LAIR1基因3’端非翻译区多态性与胃癌发病风险的关系研究

林辉 徐丹萍 诸溢扬 郑路亚

在我国，胃癌发病率居所有恶性肿瘤的前三位，且有明显的地域差异。胃癌发病年龄集中在50岁以上人群，且男女发病率明显失衡。人白细胞相关免疫球蛋白样受体 1（leukocyte-associated Ig-like receptor 1，LAIR1）几乎表达于所有免疫细胞，包括NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、单核细胞衍生树突状细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞及肥大细胞等[1]。LAIR1的细胞质尾有2个ITIM基序，体外研究表明LAIR1通过单克隆抗体与分子间的交联反应，使细胞质尾的ITIM基序的酪氨酸磷酸化，再招募SHP-1、SHP-2和Csk发挥免疫抑制功能[2]。查询国外千人项目基因组测序数据库（IGSR）发现，中国西双版纳傣族与北京汉族人种LAIR1基因3’非翻译区（3’UTR）单核苷酸多态性（SNP）位点基因型分布频率存在明显差异。而本研究对胃癌与慢性胃炎患者LAIR1基因3’UTR的SNP位点基因分布频率进行分析，以探讨其与胃癌发病风险的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2014年10月至2015年9月在本院经胃镜下组织活检确诊的121例胃癌患者为胃癌组，其中男 91 例，女 30 例；年龄 30～87[64（57，71）]岁；肿瘤类型：鳞癌1例，腺癌95例，印戒细胞癌4例，腺癌+印戒细胞癌20例，神经内分泌癌1例。121例患者中92例接受胃癌根治术，明确肿瘤分化程度：中高分化41例，低分化51例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期58例；淋巴结转移阳性率为36.5%。选取同期本院收治且年龄、性别与胃癌患者匹配的126例慢性胃炎患者为对照组，均接受过胃镜检查，胃镜下可见椭圆形、圆形溃疡或糜烂，组织活检结果为慢性胃炎；其中男94例，女32例；年龄 35～75[60（51，65）]岁。在 IGSR 查询到傣族、北京汉族和南方汉族人种LAIR1基因3’UTR的SNP位点详细信息，见表1。本研究经医院医学伦理委员会审查通过。

表1 LAIR1基因3’UTR的6个SNP位点详细信息

1.2 一代测序法检测LAIR1基因3’UTR序列 取乙二胺四乙酸抗凝血，按照血液DNA抽提试剂盒操作说明书（GK1072，100T，上海捷瑞生物工程有限公司）对外周血全基因组DNA进行抽提。在保守区域设置引物，采用正向引物LAIR1F-5′-CCCACAGTCCACAAAGCCCAT-3′，反向引物 LAIR1R-5′-TGAGATTCTGCCGCCTCCTAGT-3′对 LAIR1 基因的 3’UTR 的 （19∶5355287-54355435）进行PCR扩增，PCR产物片段长度为1 212bp，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行确认。全部PCR产物经割胶回收纯化，同时在中间段设置测序引物 LAIR1M-5′-TGCGTGGAGTAAAGCACAACCC-3′，采用一代测序仪（Applied Biosystems）进行正向及中段测序。

1.3 序列比对 通过dbSNP数据库在19号染色体5355287-54355435位（LAIR1基因3’UTR）可查询到267个SNP位点，两组患者的测序结果采用序列比对工具BLAST进行比对，发现主要存在6个SNP位点，见表1和图1。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件。胃癌组与对照组患者基因型及等位基因分布频率的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，并计算OR值及其95%CI来评估胃癌患者的相对风险。P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 LAIR1基因3’UTR的6个SNP位点的测序图

2 结果

2.1 LAIR1基因3’UTR的多态性检测结果 两组患者LAIR1基因3’UTR的 6个SNP位点基因分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。胃癌组患者rs199714928位点G/A基因型及等位基因A分布频率均明显低于对照组，G/G基因型及等位基因G分布频率均明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 2～3。胃癌组 rs1054033 与 rs6509867 位点均存在完全单倍型连锁现象，而对照组有16例存在不完全单倍型连锁现象（P＜0.05），见表4。

2.2 LAIR1基因3’UTR的多态性与胃癌分化程度的关系 不同胃癌分化程度患者LAIR1基因3’UTR的多态性位点基因分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。胃癌低分化患者rs3826753/rs3826754位点A/A基因型及等位基因A分布频率均明显低于中高分化者，等位基因G分布频率明显高于中高分化者，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表5～6。不同性别、肿瘤类型、TNM分期、淋巴结转移阳性率患者LAIR1基因3’UTR的SNP位点基因分布频率比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表2 两组患者LAIR1基因3’UTR区6个SNP位点基因型分布频率比较[例（%）]

表3 两组患者LAIR1基因3’UTR区6个SNP位点等位基因分布频率比较[例（%）]

表4 两组患者LAIR1基因3'UTR区rs1054033与rs6509867等位基因连锁比较[例（%）]

3 讨论

LAIR1早在1997年就被克隆，同时发现它被DX26抗体识别与结合后可抑制NK细胞的细胞毒功能[3-5]。LAIR1是由287个氨基酸序列组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，包含了独特的膜外C2型Ig样区域和细胞质尾的2个ITIM基序[1,6]。根据分化抗原簇，LAIR1又被命名为CD305，在结构上与其他定位在染色体19q13.4上的淋巴细胞受体复合物的抑制性Ig超家族成员相似。研究发现，LAIR1基因参与抑制粒细胞-单核细胞刺激因子（GM-CSF）诱导急性髓系白血病细胞增殖，与胶原蛋白结合后强烈抑制GM-CSF介导的细胞内钙增加、磷酸化、AKT1/PKBα活化[7]。LAIR1基因的功能性配体是胶原蛋白，当羟脯氨酸存在时具有高亲和性。体外研究发现，不管是细胞系还是原发细胞中的胶原蛋白，与LAIR1基因结合均能直接抑制免疫细胞的生物学活性[8]。LAIR1基因广泛表达且其周围存在大量配体，因此必须调节LAIR1基因/胶原蛋白的相互反应，从而确保免疫系统的平衡。一方面，作用于细胞的活化信号强度由LAIR1基因/胶原蛋白的交联反应来决定信号是否被抑制；另一方面，LAIR1基因表达水平决定其与胶原蛋白反应的抑制水平。

表5 LAIR-1基因3’UTR区6个SNP位点基因型分布频率与胃癌分化程度的关系

表6 LAIR-1基因3’UTR区6个SNP位点等位基因分布频率与胃癌分化程度的关系

目前关于LAIR1基因与实体瘤的关系研究较少。已有研究表明肿瘤患者血清可溶性LAIR1基因表达高于正常人，且外周血中NK细胞、CD4+及CD8+T细胞表面LAIR1基因表达明显增加[9]。研究表明，宫颈癌组织及上皮卵巢癌组织LAIR1蛋白表达均高于正常癌旁组织，且与肿瘤大小、病理分期、临床分级和淋巴结阳性数有关[10-11]。将LAIR1基因转染到不表达LAIR1基因的Me-180细胞并使其稳定表达，结果发现过度表达LAIR1蛋白会抑制细胞的增殖能力和抗凋亡能力[10]。然而，对表达LAIR1基因的HO-8910细胞进行基因敲除并使其基因表达沉默，结果发现细胞增殖能力及细胞侵袭能力反而增强[11]。

本研究对胃癌与慢性胃炎患者LAIR1基因3’UTR的多态性进行检测，结果发现胃癌患者rs199714928位点G/G基因型及等位基因G分布频率均明显高于慢性胃炎患者；但在中国西双版纳傣族人种（93例）中发现此位点全为纯化子（G/G），与此位点祖先等位基因G一致，这表明rs199714928位点部分G突变成A可能是生物进化的原因，以保护机体抵抗胃癌的发生。同时还发现胃癌患者rs1054033与rs6509867位点均存在完全的C-G和T-T单倍型连锁现象，而慢性胃炎患者存在16例突破该连锁现象的T-G单倍型。可见，rs1054033与rs6509867位点出现T-G单倍型是一种保护机体抵抗胃癌发生的现象。进一步分析发现，胃癌低分化患者rs3826753/rs3826754位点A/A基因型及等位基因A分布频率均明显低于中高分化者，等位基因G分布频率明显高于中高分化者；而不同性别、肿瘤类型、TNM分期、淋巴结转移阳性率患者LAIR1基因3’UTR的SNP位点基因分布频率比较，差异均无统计学意义。

综上所述，LAIR1基因3’UTR的rs199714928位点多态性可能是胃癌发生的易感因素；rs1054033与rs6509867位点存在不完全单倍型连锁（T-G单倍型）可能是一种保护机体抵抗胃癌发生的有利因素。