狼尾草属优质牧草SRAP遗传多样性分析与指纹图谱构建

石秀兰，陈 平 ，于得水，韩瑞宏，刘 萍

（1.仲恺农业工程学院园艺园林学院，广东 广州 510225；2.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070）

狼尾草属（Pennisetum Rich.）牧草是我国南方地区主要种植的牧草资源，具有生长快速、生物量大、利用价值高及耐瘠、耐肥、适应性强等特点［1］，因此其应用范围延伸到水土保持、环境绿化、观赏和能源燃料、造纸等多个方面［2-4］。狼尾草属育种受到国内外学者的普遍重视，因此培育出不少新的狼尾草品种（系）。我国自1981年引进美洲狼尾草和象草杂交种取得巨大经济效益和生态效益后，也在狼尾草属牧草引种驯化、杂交育种等方面取得了明显进步。人工选择以及环境等多因素的影响，使狼尾草属牧草间易出现较大的遗传分化［5］；植物遗传距离和地理来源关系复杂化［6］，易导致育种工作者不能准确地鉴定种质来源和父母本的归属。

近年来，利用RAPD和ISSR分子标记［7-11］对狼尾草属牧草遗传多样性研究已有较多报道，为种质资源的准确鉴定、亲本的合理选配奠定了理论基础。但由于稳定性、操作难度和可重复性方面的局限影响了标记的准确性［12］。相关序列多态性扩增（sequence-related amplified polymorphism, SRAP）是以PCR为基础的新型分子标记方法［13］。该标记方法因便捷、稳定、高效等优点被广泛应用于指纹图谱构建、遗传多样性分析、品种鉴定等方面［14-16］。姚法运等［17］利用SRAP技术分析了19份狼尾草资源间的遗传关系，认为SRAP技术具有很好的应用价值。鉴于此，本研究以仲恺农业工程学院选育的杂交狼尾草新品系1号、2号及生产中常用的狼尾草为研究对象，利用SRAP标记进行遗传差异分析并构建指纹图谱，以期为狼尾草新品种的鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的狼尾草种质材料共13份（表1）。选取长势相近的植株，在相同叶位取样，每株植株自下往上选取3片叶，同一植株不同茎均采取相同方法，目的是为了尽量选取相同植株上最嫩的叶片，以提高植物DNA活性，保持取样方法一致。

1.2 基因组DNA提取

狼尾草基因组DNA提取参照于得水等［18］的方法，于0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

1.3 SRAP-PCR扩增

参照文献［19-21］的引物序列，选取正向引物6条、反向引物12条（表2），随机组合成72对SRAP引物组合，对供试材料进行扩增。SRAP反应采用25 μL体系：10×buffer 2.5 μL、Mg2+1.75 mmol/L、dNTPs 0.26 mmol/L、引物0.15 μmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA 50 ng；PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min、35℃退火1 min、72℃延伸2 min，5个循环；94℃变性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸2 min，35个循环；最后72℃延伸5 min，4℃保存［20-22］。扩增产物采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离；参照Zhang等［23］的方法快速银染检测，在Vilber Lourmat CN1500凝胶成像系统中观察拍照。

表1 供试狼尾草材料及产地

表2 SRAP-PCR引物序列

1.4 数据分析

根据电泳结果分析扩增条带，参照文献［20-21］方法，利用Quantity One软件，以每个扩增片段出现或缺失计为“1”或“0”，计算引物多态性条带百分率（多态性带数/总带数×100%）；利用NTSYS－pc2.10软件进行Shonnon信息指数（I）、Nei's基因多样性指数（H）、遗传距离（GD）、相似系数（GSC）等参数的分析，采用UPGMA进行聚类分析，绘制聚类图；构建13份狼尾草种质材料的DNA指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 狼尾草SRAP标记的多态性

用72对SRAP引物对供试13份狼尾草材料进行PCR扩增，最终筛选出条带清晰、多态性高的16对引物（表3）。从表3可以看出，16对引物扩增出278条清晰条带，平均每对引物扩增17.37条清晰条带，其中有218条具有多态性，多态性比率平均为78.42%，分布范围为68.18%～88.89%，其中最高引物组合为F1R5（88.89%），最低引物组合为F5R10（68.18%）；不同引物组合条带扩增数量有一定差异，其中引物组合为F3R5、F5R10条带扩增数量最多（22条），最少的条带扩增引物组合F1R1、F4R3（11条）；16对引物的扩增产物介于50～500 bp之间。引物组合F6R7扩增结果见图1。

图1 引物组合F6R7对狼尾草的扩增结果

表3 16对引物扩增条带的多态性

2.2 13份狼尾草种质遗传多样性

13 份狼尾草的遗传相似度（GSC）为0.3776～0.9796，遗传距离（GD）为0.0206～0.9740，说明各品种（系）间存在较大的遗传差异。由表4可知，13份狼尾草材料中以皇竹草和矮生皇竹草的遗传距离最近、为0.0206，遗传相似度最高、为0.9796；以桂牧1号和多穗狼尾草的遗传距离最远、为0.974，遗传相似度最小、为0.3776。

Nei's 基因多样性指数（H）和Shonnon信息指数（I）是衡量遗传变异最常用的两个指标，13份狼尾草的平均H值为0.3306±0.1308，平均I值为0.5017±0.1587。不同品种狼尾草各基因位点遗传多样性程度存在较大差别，I最大值为0.6902，最小值为0；H最大值为0.4970，最小值为0。经分析表明，狼尾草不同品种的遗传多样性较丰富，遗传变异较大，说明SRAP标记能够很好地揭示狼尾草种质资源间的遗传差异。

2.3 13份狼尾草属植物的DNA指纹图谱

在16对扩增带型清晰、重演性好、多态性高的引物组合中，利用其中1对引物组合F6R7构建了13份狼尾草属植物的DNA指纹图谱（图2）。由图2可知，图谱含有DNA多态性条带109条，多态性位点17个，带型间有明显差异，可有效区分13份狼尾草材料并加以准确鉴定。

图 2 13个狼尾草属植物的DNA指纹图谱

表4 狼尾草属植物的的遗传距离及遗传相似度

2.4 13份狼尾草属植物的聚类分析

根据相似系数矩阵按UPGMA法将13份狼尾草品种聚类，形成了13份种源的亲缘关系聚类图（图3）。在遗传相似度0.634处，将参试材料分为2大类：Ⅰ类包括杂交狼尾草、2份杂交狼尾草芽变系（杂交狼尾草1号、杂交狼尾草2号）及多穗狼尾草形成单独分支；在相似度为0.884处，可分为2分支，杂交狼尾草及其2份芽变系聚为一类，多穗狼尾草单独一类，其中杂交狼尾草2号芽变系的遗传距离和杂交狼尾草原种更近些。Ⅱ类包括象草原品种、摩特矮象草及象草新品系、皇竹草及其矮生系、桂牧1号及3个地方品种单独聚为一大类；在相似度为0.86处，可将Ⅱ类分为3个分支，皇竹草和其矮生系单独聚为一类；桂牧1号、象草、江西象草湖光岩象草聚为一类，其中江西象草与桂牧1号的遗传距离较近；摩特矮象草和象草新品系、华南象草聚为一类，其中摩特矮象草和象草新品系的遗传距离相近聚为一类。

图 3 13份狼尾草属植物的UPGMA聚类结果

3 讨论

3.1 13份狼尾草种质聚类分析与品种实际来源的一致性

杂交狼尾草与其两个芽变系（杂交狼尾草1号和2号）的遗传距离分别为0.1423和0.0524。从分子水平上证明了仲恺农业工程学院选育的杂交狼尾草1号和2号来源的准确性，与陈平等［7］RAPD标记的结果正好相符。由华南农业大学选育的象草新品系及其源种摩特矮象草的遗传距离为0.0852，也印证了解新明等［8］RAPD标记的相关结论。皇竹草及其矮生系的遗传距离最近为0.0206，相似度为98%，说明皇竹草矮生系的变异程度未达到以新品种的形式推广种植，或许是由于其种植条件不同而造成皇竹草植株的矮化，推广的地理位置不同而形成的植物适应性表现。桂牧1号和地方品种江西象草的遗传距离为0.0311，可由此推断江西象草有可能是广西的桂牧1号引种至江西后形成的一个适应当地气候条件的地方品种，或者是由于天然杂交而导致的样品不纯。湖光岩杂交象草与桂牧1号、江西象草的遗传距离相似，也可能是引种至当地后形成的地方新品种。桂牧1号是由美洲狼尾草和象草杂交后代F1回交所得。象草在整个遗传育种过程中出现过2次，其遗传基因也占据较大比例，象草与桂牧1号聚为一类，地方品种江西象草和湖光岩象草与源种象草聚为一类。华南象草于1960年从印尼引进，在华南各地大量繁殖，进而成为野外散生的地方品种，是我国最早引进的牧草种质，其后代不断与其他狼尾草属植物杂交导致基因序列改变，造成植物形态和生长习性与其源种差异显著，它与摩特矮象草的遗传距离较近（GD=0.1782），说明本地散生的华南象草与摩特矮象草有着某种遗传关系。

3.2 SRAP标记对狼尾草新品种鉴定的可行性

Budak等［24］以野牛草为材料，运用不同标记方法研究，产生的多态性SRAP为95%、ISSR为81%、RAPD为79%和SSR为87%，认为SRAP标记好于其他几种标记。Ferrio等［25］认为SRAP标记重复性好于RAPD，相比AFLP操作更简单，更贴近植物种源进化史和形态变异，所用引物没有物种特异性，尤其在研究背景缺乏的条件下优势明显。对于自然变异后代来说，由于与其亲本基因和形态的相似性，运用常规方法难以区分它们，甚至一些分子手段也不能将其完全区分［26］。狼尾草受环境条件影响易发生变异，本研究中，杂交狼尾草及其芽变系（杂交狼尾草1号和杂交狼尾草2号），摩特矮象草及其变异系（象草新品系），它们之间遗传距离特别近，但是运用SRAP方法依然能够清晰地鉴别出它们之间的差异。本研究也表明，利用SRAP引物建立的13份狼尾草属品种的指纹图谱，可以用于鉴定纷繁复杂的狼尾草属不同变异系的品种（系）。姚运法等［17］的研究也证明了SRAP在狼尾草属牧草品种间鉴定及分析遗传关系方面具有很好的应用价值。可见，SRAP标记对狼尾草属不同品种鉴定是可行的。