蒙药制剂其格日木汤中羟基红花黄色素A含量的测定

杨 洋 李 珍 丁 华 郭 慧 张 烨

(内蒙古自治区鄂尔多斯市药品医疗器械检验研究中心，内蒙古 鄂尔多斯 017000)

其格日木汤由五灵脂、红花、丹参、北五味子、甘草、栀子、川木通、瞿麦、柯子、川楝子、苦地丁、黄连、猪胆粉等13味药组成[1]，本文主要测定方中红花的含量。红花化学成分比较复杂，富含黄色素与红色素，所含的脂肪油俗称为红花油[2]。从红花中分离确定的化学成分主要有含黄酮类物质、脂肪酸、色素、酚酸、挥发油等多种活性成分[3]，其中起活血化淤作用的主要有效成分是红花黄色素，属于醌式查尔酮类化合物，是红花发挥药理作用的物质基础。Meselhy MR 等[4]于1993 年从红花中分离得到的羟基红花黄色素 A ( hydroxysafflor yellow A，HSYA) ，是红花黄色素中含量较高的成分，其含量的多少对红花的药效有着直接影响[5]。中国药典一部从2005年版[6]开始收录并规定以 HYSA为红花中的代表性活性成分进行含量测定。在蒙药制剂其格日木汤含量测定的标准研究过程中，方中红花以HYSA作为测定指标，采用高效液相色谱法测定含量。通过试验摸索，确定了较为理想的色谱条件，经过方法学考察及阴性对照实验，表明该方法简便，重现性好，专属性较强，且方中其他组分对HYSA的测定无干扰，为蒙药制剂其格日木汤中红花成分的定量提供了科学依据。

1 仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪，PDA检测器；岛津UV-1700型紫外分光光度计；KQ-500DE型数控超声波清洗器。

羟基红花黄色素A对照品(批号：111637-201308；中国食品药品检定研究院)；其格日木汤由本中心蒙研所提供。甲醇、乙腈为色谱纯；水为高纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性 采用Kromasil C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.7%磷酸溶液(三乙胺调pH值至6.0±0.1)-甲醇-乙腈为流动相，流速1.0 mL·min，柱温40 ℃，进样量10 μL。羟基红花黄色素A峰的理论塔板数均大于3000，与相邻杂质峰的分离度均大于1.5。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品储备液 精密称取羟基红花黄色素A对照品1.94 mg，置25 mL容量瓶中，加25%甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL溶液中含羟基红花黄色素A 0.786 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取其格日木汤样品约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇50 mL，称定重量，超声处理45 min，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 取按处方比例并以相同工艺制备的缺少红花的阴性对照，按与供试品溶液相同的方法制备阴性对照溶液。

2.3 专属性考察 采阴性对照试验。在同一色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各10 μL，测定液相色谱图，结果阴性对照溶液的色谱图中在与羟基红花黄色素A对照品以及供试品色谱图相对应的保留时间处无色谱峰出现，表明其他组分对羟基红花黄色素A的测定无干扰。

2.4 线性关系考察 精密吸取对照品储备液0.5、1、2、3、4、5 mL，分别置5 mL量瓶中，用25%甲醇定容至刻度，摇匀，按2.2项色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，经线性回归处理得羟基红花黄色素A回归方程为y=11493x+3211.2 r=0.9996，线性范围为0.776～7.760μg。

2.5 稳定性试验 取上述其格日木汤供试品溶液，分别于0、2、4、8、24、32 h进样10 μL，记录峰面积。结果羟基红花黄色素A峰面积的RSD为1.23%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

表1 不同时间测定样品中羟基红花黄色素A的峰面积

2.6 精密度试验 取对照品溶液，连续进样6次，记录羟基红花黄色素A峰面积，计算RSD(n=6)为1.6%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 取同一批其格日木汤6份，每份约1.5 g，精密称定，按2.1.2项下方法制备供试溶液，分别进样10 μL，记录峰面积，并计算含量。羟基红花黄色素A的平均含量为1.0596 mg·g-1，RSD为0.90%。表明该方法重复性良好。

表2 羟基红花黄色素A含量重复性试验结果

2.8 加样回收率试验 精密称定已测定含量的其格日木汤样品6份(平均含量为1.0596 mg/g)，每份约0.75 g，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，各精密加入羟基红花黄色素A对照品储备液 1 mL，按2.3项下方法制备供试溶液，分别进样10 μL，记录峰面积，计算羟基红花黄色素A的量，计算回收率。结果羟基红花黄色素A平均回收率(n=6)为100.9%，RSD=1.41%。表明该方法回收率良好。

表3 羟基红花黄色素A加样回收率试验结果

3 样品含量测定

取3批蒙药制剂其格日木汤，分别按2.1.2项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，记录羟基红花黄色素A峰面积，采用外标峰面积计算含量。

表4 样品含量测定结果(mg·g-1)

4 讨论

4.1 提取条件的选择 羟基红花黄色素A为黄酮类成分，选用25%甲醇作为提取溶剂进行超声溶解提取，比较超声15、30、45和60 min等不同提取时间对提取效率的影响，并测定含量，结果显示超声45 min后供试品溶液中羟基红花黄色素A的含量基本稳定不变，故将提取时间定为超声处理45 min。

4.2 流动相的选择 以0.7%磷酸溶液-甲醇-乙腈为流动相为流动相，进行流动相条件摸索，当流动相比例为76:26:2时，样品中的杂质峰分离度小于1.5，调节流动相比例至79:19:2，羟基红花黄色素A峰与其它成分的分离度大于1.5，但是对照品羟基红花黄色素A峰型不对称，加三乙胺调节pH值至6.0时，峰型对称，故将流动相确定为0.7%磷酸溶液(三乙胺调pH值至6.0±0.1)-甲醇-乙腈。

4.3 检测波长的选择 取羟基红花黄色素A对照品溶液，于紫外可见光分光光度仪，自200 nm～700 nm做光谱扫描，羟基红花黄色素A在波长403 nm与224 nm处有最大吸收。选择不同波长考察并且对比后发现，对于羟基红花黄色素A在224 nm下的出峰面积无法达到定量要求，为了保证定量准确，结合相关文献[6]选用403 nm作为检测波长，方法学考察表明在该波长下结果稳定、可靠。

5 结论

通过本文的研究考察，对3批蒙药制剂其格日木汤中红花的含量进行了测定，考虑到不同产地、不同采收季节对红花的影响以及制药过程中的损耗，并结合检测样品的实际羟基红花黄色素A含量，确定每1 g其格日木汤制剂含红花以羟基红花黄色素A(C27H30O15)计，不得少于0.50 mg。