高效液相色谱法测定甘蔗叶片中脱落酸

高欣欣，刘少春，刀静梅，方志存，邓军，樊仙

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南 开远661699）

甘蔗(Saccharum officinarum L.)是全球种植面积最大的糖料作物，约占世界产糖量的65%[1]。甘蔗具有高生物量和高纤维的特点，是重要的可再生能源作物。脱落酸（Abscisic acid,ABA)作为甘蔗生长发育的重要调节剂，在甘蔗出芽与分蘖、脱叶与成熟、病虫害防治等方面具有重要作用[1－4]。因此，了解甘蔗内源ABA的变化规律，对于研究甘蔗宿根性和抗逆性，提高甘蔗产量和品质都具有重要意义。

植物内源ABA具有含量少、易分解、难提纯等特点，目前应用在ABA上的检测方法较多[5－8]，鉴于高效液相色谱法在灵敏度、重现性、精确度、选择性等各个方面明显优于其它几种检测方法，现已被广泛应用于多种植物内源ABA含量测定[9－13]，但是利用高效液相色谱测定甘蔗叶片中内源ABA尚未见相关报道。本试验通过浸提、萃取、过柱等前处理方法对甘蔗叶片中内源ABA进行提纯浓缩，并采用高效液相色谱法对其含量进行检测鉴定，以期为研究甘蔗内源ABA的生理调控机制提供理论依据。

1 实验部分

1.1 材料、仪器及试剂

试验样品均采自云南省农业科学院甘蔗研究所试验基地。

试验品种为‘桂糖02－467’，于2016年2月种植，生长期田间管理与当地甘蔗生产管理水平一致。2016年11月甘蔗进入成熟期后，于甘蔗成熟早期（11月25日）取甘蔗上部叶片－20℃保存，待用。

Waters e2695高效液相色谱仪，配紫外检测器（美国沃特斯科技有限公司）；RE－52AA型旋转蒸发仪（上海谷宁科技有限公司）；PS－100A超声清洗器（深圳市超艺达科技有限公司）；DL－3010型低温冷却循环仪（上海谷宁科技有限公司）。ABA标准品（HPLC级，Sigma公司）；石油醚（分析纯，天津光复科技发展有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国默克公司）；水（娃哈哈纯净水）。

1.2 标准溶液配制

利用甲醇溶液溶解适量ABA标准物质，得到标准液母液（质量浓度：1 000 mg/L）；取ABA标准液母液，利用甲醇溶剂逐级稀释为0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的标准溶液，各标准溶液4℃避光保存。

1.3 HPLC仪器条件

色谱柱：SunFireTM C18液相色谱柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A 为甲醇，B 为 0.5%冰醋酸溶液（40∶60）；等度洗脱；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL；紫外全扫描图谱，检测波长：254 nm；柱温：30 ℃。

1.4 样品前处理

结合文献[7－12]以及预实验结果，甘蔗叶片前处理方法总结为：称取甘蔗叶片样品15 g，液氮研磨；4℃避光条件下，分别用甲醇和80%甲醇溶液80 mL转移至150 mL磨口烧瓶中，重复2次，合并浸提液；40℃条件下，通过旋转蒸发仪对浸提液进行减压浓缩至无甲醇残留后，利用30 mL石油醚脱色，重复3次；弃去醚相后过C18小柱对目标检测物进一步提纯，用20 mL 40%甲醇进行洗脱，收集洗脱液。1 mol/L盐酸溶液调节洗脱液pH至3.0，并用3×30 mL乙酸乙酯进行萃取，此时ABA以分子形式存在，在乙酸乙酯中的溶解度远大于在水相中的溶解度；合并乙酸乙酯萃取液过无水硫酸钠进行干燥，并于40℃条件下减压蒸干，残渣进行甲醇溶解并定容至2 mL，过0.45 μm滤膜去除杂质后进样，测量不同提取溶剂中ABA含量，确定最佳提取溶剂。

1.5 方法学考察

1.5.1 线性关系、检出限和精密度 利用优化后色谱条件，对质量浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的标准溶液进行测定。绘制标准曲线，计算该方法的线性关系、检出限和精密度。

1.5.2 加标回收实验 取空白样品和甘蔗叶片研磨样品各3份，分别添加1 mg/L、2 mg/L和5 mg/L 3个不同浓度ABA标准溶液1 mL，按照优化后的色谱条件和检测方法测定ABA含量，计算回收率。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂和提取时间的确定

根据甘蔗叶片样品内源ABA的理化性质以及相关文献报道，选择甲醇和80%甲醇作为提取溶剂，分别比较浸提时间为 2 h、6 h、12 h、18 h、24 h 条件下样品中ABA含量，各处理重复3次。试验结果如表1所示，利用甲醇试剂浸提甘蔗叶片样品，甘蔗叶片样品中ABA含量远高于80%甲醇浸提结果，表明甲醇对ABA的提取效果优于80%甲醇。12 h时甘蔗叶片样品ABA平均含量为200.8 μg/kg，达到最高峰，且随提取时间加长，ABA含量呈递减趋势，因此选择提取时间为12 h。在上述优化实验条件下，ABA的标准溶液和甘蔗叶片样品色谱图见图1。

表1 不同溶剂不同浸提时间甘蔗叶片内源ABA含量

图1 （a）ABA标准溶液及（b）甘蔗叶片样品色谱图

2.2 仪器色谱条件的选择

2.2.1 流动相的选择 在已报道的利用HPLC测定植物内源ABA的相关文献中，流动相大多数采用甲醇－水体系进行等度洗脱的方法，本试验在流动相中加入少量乙酸溶液，利用甲醇－水和甲醇－0.5%乙酸溶液两个流动相进行实验对比，结果表明，目标物与样品均能较好地分离，但是甲醇－水体系色谱峰有较严重的拖尾现象，峰形较差。在流动相中加入少量乙酸溶液，可以明显改善峰形，减少拖尾的同时提高响应值，因此选择甲醇－0.5%乙酸溶液作为流动相。

2.2.2 柱温的选择 将柱温分别设置为30、40、50℃，考察色谱柱温度对甘蔗叶片样品中各个组分分离的影响，发现柱温每上升10℃，ABA保留时间提前约5 min，在3个柱温条件下ABA均能较好地出峰，峰形尖锐，峰面积变化不大，说明柱温对ABA的影响不显著，因此，选择30℃作为柱温。

2.2.3 最大吸收波长的确定 将吸收波长分别设置为275 nm和254 nm，利用ABA标准溶液，进行紫外全扫描图谱，确定ABA的最大吸收波长为254 nm。

2.3 方法学考察

在2.2优化色谱条件下，对0.25～10.0 mg/L的标准溶液进行测定，以目标峰面积（y）对标准工作溶液的质量浓度（x）进行线性回归，得到线性回归方程y=34466x+7085，相关系数r2=0.996，说明ABA在0.25～10.0 mg/L范围内具有良好的线性关系。将最低浓度的标准溶液平行测定10次，以3倍信噪比（S/N=3）对应的目标物浓度作为检出限LOD=0.0202 mg/L，以S/N=10对应的目标物浓度作为定量限LOQ=0.0675 mg/L。

2.4 回收率

取空白样品和甘蔗叶片样品，每个处理重复3次，分别添加1 mg/L、2 mg/L和5 mg/L ABA标准溶液1 mL，按照2.2优化后的色谱条件和检测方法测定ABA含量，计算回收率。试验结果如表2所示，ABA回收率为87.5%～102.4%，符合实验要求。

表2 甘蔗叶片中ABA的回收率

2.5 实际样品分析

利用2.1和2.2所建立的方法测定5个甘蔗叶片样品（A、B、C、D、E、F）中内源ABA含量，每个样品重复3次。从表3中可以看出，甘蔗叶片中ABA含量范围为149.27～202.31 mg/kg，实现了甘蔗叶片样品ABA含量的快速测定。

表3 实际甘蔗叶片中ABA的含量

3 结论

目前植物内源ABA检测方法主要有毛细管电泳法（CE）[15]、酶联免疫法（ELISA）[16]、气相色谱法（GC）[17]等，但相较于HPLC检测植物内源ABA含量，这些方法在准确定性、适用范围、抗干扰能力等方面均存在不足，HPLC分析方法具有灵敏度高、选择性好、抗干扰力强等优点。

采用HPLC法测定甘蔗叶片中内源ABA含量，甘蔗叶片样品液氮研磨后利用甲醇避光浸提，石油醚脱色，通过C18小柱和乙酸乙酯萃取对样品中ABA进一步提纯萃取。利用C18（5μm，200 mm×4.6 mm）不锈钢柱分离，以甲醇－0.5%冰乙酸溶液（40∶60）为流动相，流速1 mL/min，柱温30℃，在254 nm波长下检测。在此条件下检测甘蔗叶片中ABA含量，具有分离度高、峰形好、保留时间长等优点。对该方法进行精确性、稳定性和重复性试验分析，结果表明，该方法前处理过程简单，样品中的ABA在0.25～10 mg/L范围能呈现良好的线性关系（r2=0.996），加标回收率为87.5%～102.4%，相对标准偏差不大于5%，检出限LOD=0.0202 mg/L，定量限LOQ=0.0675 mg/L。该方法灵敏度高、重复性好、回收率满意，可应用于甘蔗叶片样品中ABA的测定。