伪狂犬实时荧光定量PCR检测方法的建立

刘国英，商晓桂，范秀丽，张贵刚，郝鹏，闫聪，韩志玲

（金宇保灵生物药品有限公司，呼和浩特 010030）

0 引言

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（PseudorabiesVirus，PRV）引起的B类传染病[1]（OIE认定），分布广泛，危害严重，可以感染不同年龄段的猪，但以妊娠母猪和哺乳仔猪感染最为严重。该病导致妊娠母猪流产、产死胎和木乃伊胎；哺乳仔猪出现神经症状、麻痹、衰竭死亡[2]，死亡率几乎高达100%。目前PR已成为对全球养猪业危害最大的传染病之一，每年给养猪业造成了巨大的经济损失。

伪狂犬病毒又称猪疱疹病毒Ⅰ型，属于疱疹病毒科中的α疱疹病毒亚科，基因组为双链DNA分子，大小约150 kb，成熟病粒子携带50余种蛋白[3]。gE、gG、gI、TK等毒力基因是其复制非必需基因，其编码的蛋白为非必需糖蛋白，缺失这些基因后，其复制扩增及抗原性并不受任何影响，但毒力却降低，其中gE基因是伪狂犬的主要毒力相关基因，也是世界动物卫生组织所规定基因缺失疫苗的首选缺失基因[4]。目前，欧美等发达资本主义国家应用gE基因缺失疫苗及其配套的鉴别诊断方法已实现了伪狂犬的净化，中国也已广泛使用gE基因缺失弱毒疫苗用于伪狂犬的预防和控制。gB基因为伪狂犬病毒复制所必需的基因，在野毒株与基因缺失株中均存在[5]，因此可以通过对gB基因和gE基因进行检测，区分所感染伪狂犬病毒的类型。

目前，国内外常用的实验室诊断伪狂犬病毒的方法主要包括病毒分离、兔体接种试验、抗体诊断、病原学诊断、分子生物学诊断等几大类，其中分子生物学诊断中的荧光定量PCR检测技术以其快速、简便、准确等优点成为快速发展的检测手段。该发明通过建立针对gB基因和gE基因的双重荧光定量PCR方法，能快速鉴别伪狂犬病野毒株与基因缺失株，并对病毒拷贝数进行精确定量[6-7]，为伪狂犬病毒的快速诊断提供科学依据，也对伪狂犬疫苗的生产具有指导作用，同时对于疫病的控制和净化具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

伪狂犬病毒样品为实验室的伪狂犬弱毒株与强毒株细胞培养物、伪狂犬弱毒株细胞培养物浓缩样品、病料等；阳性对照为伪狂犬弱毒株细胞培养物。

1.1.2 试剂

PCR 4-TOPO载体、Easy Dilution、X-gal、IPTG、Amp+、6*loading buffer、T4 DNA连接酶、Premix Ex Taq（Probe qPCR）、DNA Marker、Ex Taq聚合酶、限制性内切酶、DNAzol试剂、柱式质粒小量抽提试剂盒、柱式DNA胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒等。

1.1.3 仪器

荧光定量PCR仪、高速台式冷冻离心机、电泳系统、凝胶成像仪、核酸蛋白检测仪、低温高速离心机等。

1.2 实时荧光定量PCR方法的建立

1.2.1 引物与探针设计

对GenBank中的伪狂犬病病毒gB基因和gE基因的DNA序列进行比对，选取gB、gE基因高度保守且具有特异性的序列，设计Taqman探针和引物。gB基因上游引物为：GGATCTCGCTGTAGTCCAGGAG；下游引物为：GAGGTGCCCGAGACGATCAG；探针序列为：（FAM）TGACCCTGAACCTGACGCTGCTGGA（TAMRA），扩增片段长度为133 bp。gE基因上游引物为：CTCGTGATGACCCACAAAGG；下游引物为：CTTGATGACCGTGACGTACTC；探针序列为：（ROX）CGCCACCTGGGACTACACGCT（BHQ2），扩增片段长度为84 bp。引物和探针序列由TaKaLa公司合成。

1.2.2 阳性标准品的制备

在伪狂犬病病毒gB基因和gE基因的保守区域分别设计包含荧光定量PCR扩增片段的引物，用于标准品制备，gB基因上游引物为：GGACAGGAAGGACACCAT；下游引物为：CTACGAGGACTACAACTACG，扩增片段长度为364 bp。gE基因上游引物为：GACGACGATGACCTCAA；下游引物为：CTCCTTGATGACCGTGAC，扩增长度为990 bp。引物序列均由TaKaLa公司合成。将纯化回收的含有伪狂犬病毒gB基因和gE基因目的片段分别克隆至pGEM-T载体中，构建成重组质粒，用Nanodrop测定浓度，计算gB基因和gE基因标准品的拷贝数分别为：2.7×1010copies/μL，2.1×1010copies/μL，按照比例用无酶水对DNA标准品进行稀释，使拷贝数为1×1010copies/μL，按每管20 μL进行分装。

1.2.3 双重荧光定量PCR反应体系和反应条件的建立

双重荧光定量PCR反应的体系为：Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5 μL，gB基因和gE基因上下游引物各0.5 μL，探针各1 μL，DNA模板2 μL，无酶水6.5 μL。反应条件为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，45个循环，4 ℃保存。

1.2.4 双重荧光定量PCR标准曲线的建立

取gB基因和gE基因标准品用无酶水做10倍梯度稀释，使模板浓度为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL，每个样品2个重复，以各标准品的浓度log值（X轴）对其相应CT值（Y轴）作图，绘制标准曲线。

1.2.5 灵敏性验证

以伪狂犬gB基因和gE基因拷贝数为1×101～1×108copies/μL的DNA标准品为模板，通过双重荧光定量PCR检测拷贝数梯度的扩增情况，并将荧光定量产物进行电泳，以比较荧光定量方法和普通PCR检测方法的灵敏性。

1.2.6 重复性验证

（1）组内重复性验证。

随机选取6支伪狂犬病毒细胞培养物，用DNAzol提取DNA后，利用建立好的双重荧光定量检测方法对样品进行荧光定量检测，每个样品各做5次重复。对各样品的CT值计算平均数和标准偏差，验证组内重复性。

（2）组间重复性验证。

随机选取10支伪狂犬病毒细胞培养物，用DNAzol提取DNA后，利用建立好的标准曲线分别进行5次荧光定量PCR检测，每次每个样品各做2个重复，对5次试验结果的数据进行统计分析，验证建立体系的组内重复性。

1.2.7 特异性验证

分别用DNAzol对伪狂犬、猪瘟、BVD、IBR、羊口疮等病毒培养物提取DNA，以水为阴性对照，进行荧光定量PCR检测，验证所建立的伪狂犬双重荧光定量PCR反应体系是否具有特异性。

1.2.8 临床样品检测

利用已建立的伪狂犬双重荧光定量PCR反应体系对12份临床疑似血清病料进行检测，以水为阴性对照，以灭活的猪伪狂犬病野毒株细胞培养物和基因缺失株细胞培养物为阳性对照，对试验样品和对照样品用DNAzol提取核酸DNA后进行荧光定量检测，样品及标准品均各做2个重复。

2 结果

2.1 双重荧光定量标准曲线的建立

对拷贝数均为1×101～1×108copies/μL的伪狂犬病毒gB和gE基因标准品做荧光定量PCR扩增，gB扩增曲线和标准曲线分别见图1、图2；gE扩增曲线和标准曲线分别见图3、图4。由图1、图3可知2种标准品扩增曲线均为平滑的“S”形曲线，各稀释梯度之间相差约3个CT值，且gB基因标准曲线方程为y=－0.998x+37.806，相关系数R2=0.998，gE基因标准曲线方程为y=－0.993x+42.716，相关系数R2=0.993，说明扩增体系较好，双重荧光定量PCR标准曲线构建成功。

图1 gB扩增曲线

图2 gB标准曲线

图3 gE扩增曲线

图4 gE标准曲线

2.2 灵敏性验证

由图5电泳检测可知，双重荧光定量PCR体系可以检测到病毒的最小拷贝数为102/μL，而普通PCR方法电泳检测仅能检测到拷贝数为103/μL的结果，说明荧光定量方法的灵敏度较高。

图5 不同拷贝数荧光定量结果电泳检测

2.3 重复性验证

2.3.1 组内重复性试验

随机选取6支伪狂犬病毒细胞培养物进行荧光定量检测，每个样品各做5个重复。计算各样品CT值的平均数和标准偏差，如表1所示，各样品的5次重复性试验之间的离散度较小，重复性好，满足试验要求。

表1 组内重复性试验结果

2.3.2 组间重复性试验

随机选取10支伪狂犬病毒细胞培养物，利用建立好的标准曲线分别进行5次荧光定量PCR检测，每次每个样品各做2个重复，对5次试验结果的数据进行统计分析，见表2，各组样品离散度较小，说明重复性较好。

表2 组间重复性试验结果

2.4 特异性验证

利用双重荧光定量PCR检测方法对伪狂犬、猪瘟、BVD、IBR、羊口疮等病毒进行检测，由扩增曲线可知，仅伪狂犬病毒有双重荧光曲线，其余病毒CT值均大于38，判定结果为阴性，说明所建立的双重荧光定量PCR体系特异性好，可以用于病毒鉴定，见图6。

图6 双重荧光定量PCR特异性试验结果

2.5 双重荧光定量PCR对样品的检测

所检测的12份疑似血清中有2份血清判定为阴性（不含gB基因和gE基因，即未感染猪伪狂犬病毒），10份血清判定为阳性（感染猪伪狂犬病毒），其中4份血清为猪伪狂犬病野毒株感染（含gB基因和gE基因），6份血清为猪伪狂犬病基因缺失株感染（仅含gB基因，缺失gE基因）。检测结果见表3。

表3 疑似血清病料的双重实时荧光定量PCR检测结果

3 结束语

目前国际上对伪狂犬病的防治措施以疫苗免疫为主，但常规的血清学方法无法区分野毒感染和疫苗免疫动物[8]，对伪狂犬病的防治及后期的净化带来不便。该研究建立了针对伪狂犬病毒gB基因和gE基因的双重实时荧光定量PCR方法，能快速鉴别伪狂犬病野毒株（同时含有gB基因和gE基因）与基因缺失株（仅含有gB基因），并且灵敏度高，可以检测到拷贝数为102/μL的病毒粒子。同时，检测方法操作简便、特异性强，可以在3～4 h内对疑似样本作出诊断，且不会受到其他病原干扰。该研究建立的方法为猪伪狂犬病毒的早期诊断、感染毒株鉴定及流行病学调查提供了一种重要的技术手段，对于防治该种疾病具有重要意义。