船舶压载水取样分析方法分析

成海涛 贾在明

经过IMO及航运界的不断努力，《国际船舶压载水及沉积物控制和管理公约》（以下简称《压载水公约》）终于达到生效条件，并于2017年9月8日正式生效。但在公约实施过程中仍有各种矛盾和困难存在，实际操作中还有很多技术问题有待解决。例如，压载水取样分析方法与BWMS的型式认可取样分析方法不一致，PSC检查过程中的取样分析方法没有统一等[1]。

一、压载水取样分析现状介绍

《压载水公约》虽已生效，但仍处于经验积累期（EBP）。经验积累期实施过程分为三个阶段：数据收集、数据分析和公约审议及修订。国际海事组织海上环境保护委员会于2018年4月19日在伦敦召开第72界会议（MEPC72），会议对公约的EBP的数据收集和分析计划（DGAP）时间表做了调整，要求于2019年汇总数据向MEPC74会议首次提交，于2022年向MEPC79会议提交关于公约修正的提案[2]。

经验积累期需要收集众多的数据，其中包括BWMS试用期间使用的取样分析方法及结果。因此，PSC检查过程中会出现两种取样分析的形式：

一种是为了收集数据而进行大量详细分析的取样，可称为“自愿性取样”，此种非强制的取样分析结论不能作为判定船舶压载水处理是否满足D-2标准的依据。

另一种是依据《压载水公约》第9条，港口国检查中允许PSCO依据公约导则在必要的情况下进行的取样分析，可称为“强制性取样”，此种取样分析结论如证明船舶不符合公约要求，可以作为PSCO处罚船舶的依据[3]。

二、压载水取样分析方法

（一）检测压载水D-1标准的方法

1.压载水置换标准D-1

《压载水公约》D-1标准要求实施压载水置换的船舶容量置换率应至少达到95%；泵流法置换的船舶，每个压载舱应泵入3倍舱容的水量。压载水置换水域应距离最近陆地至少200海里且水深至少200米；如船舶不能满足上述要求时应距离最近的陆地至少50海里且水深至少200米；此外，港口国可指定船舶进行压载水置换的水域。在规定的强制压载水处理系统安装日期前，现有船必须进行压载水置换并满足D-1标准[3]。

2.压载水D-1置换标准的检测方法

D-1置换标准不涉及压载水内生物个体的定量规定，主要是验证压载水是否在深海开阔水域进行了有效置换。因此，检测方法主要是依据沿岸水域与深海开阔水域的不同特点进行区分，一般从盐度、浊度及含有机物等不同方面进行检测分析，主要的方法有：

（1）盐度分析法

由于淡水与河流汇入海中，导致沿岸水域盐度一般较深海水域低。深海水域的盐度一般都高于30 PSU，如果检测压载水的盐度远低于30 PSU则说明船舶可能没有有效置换压载水。实践中一般使用电导计或盐度计测量压载水的盐度。

应注意有些港口的盐度与开阔深海水域相似，在这些港口压载的船舶，不应将盐度分析作为压载水是否置换的唯一证据，应结合或使用其他的检测方法。尽管如此，盐度分析法仍不失为检验压载水置换的一种较有效且简便的方法[4]。

（2）有色可溶性有机物含量分析法

沿岸水域的另一特点明显区别于开阔深海水域，即有色可溶性有机物（CDOM，Colored Dissolved Organic Matter）的含量，CDOM是一种在光学上可以测量的水中溶解有机物。CDOM含量高的压载水在短波波段有强烈的吸收光谱，如蓝色到紫外；CDOM含量低或不含CDOM的压载水在长波波段有吸收，如红色。因此，CDOM值高的压载水颜色为绿色到黄绿色渐进到褐色，而CDOM值低的压载水显示出蓝色[5]。

沿岸水域受人类活动影响比较大，如工业废水、城市污水、农业活动排放废水等，会使沿岸水域的CDOM值高；随着离岸距离及水深的增加，CDOM值逐渐减小。通过使用三维荧光光谱（EEMS，Excitation/Emission Matrix Spectrometry）可以准确测出CDOM的阈值[5]。CDOM的阈值可以作为判断船舶压载水是否置换的有力证据，实践中一般使用便携式养分传感器进行船舶压载水CDOM阈值的检测。

（二）检测压载水D-2处理标准的方法

1.压载水D-2处理标准

在规定日期后，船舶必须安装BWMS处理压载水，并满足D-2标准。公约规定的D-2标准要求如表1所示：

表1 船舶压载水排放D-2标准[3]

2.压载水D-2处理标准的检测方法

压载水D-2处理标准要求比较严格，需要对压载水中的不同尺寸水生物进行定量检测。其中细菌（有毒霍乱弧菌、大肠杆菌、肠道球菌）的检测方法有相应的国际标准（ISO）可供参考，检测压载水时可直接引用；最小尺寸≥50微米的水生物一般为浮游动物，具有移动性（Mobility），可以通过立体显微镜直接计数法检测[6]，结合活体染色（下文详述）可以收到更好的效果，在压载水检测过程中基本得到认可[7]；最小尺寸≥10微米且<50微米的水生物一般不具移动性，通常为单细胞浮游植物，很难直接观测计数[8]。采取的其他检测方法有多种，同时存在的争议也比较多，下面简述对此类生物体的主要检测方法：

（1）最可能数量连续稀释培养法

最可能数量连续稀释培养法（SDC，MPN method，The Serial Dilution Culture-Most Probable Number Method）是依据活的浮游植物具有繁殖能力来观测压载水中浮游植物细胞繁殖过程中叶绿素a的量变来计算细胞数量的方法。它是一种基于一系列稀释样本中浮游植物繁殖与不繁殖数据得分的二元计分数学运算。

SDC-MPN的做法是（如图1所示）：

①取压载水样品，并进行连续的稀释。

②将稀释液样品在营养液内及适宜的光照和温度环境下培养。

③在培养的过程中，用标准实验室荧光计监测稀释液中的叶绿素荧光，活细胞会繁殖，叶绿素含量会增加，荧光信号也会增加。

图1 SDC-M PN操作方法

④在培养前，如果稀释液内有可繁殖活细胞，哪怕只有一个活细胞，都会繁殖导致叶绿素增加，显示为荧光的增加，此份稀释液计为“+”。

⑤同理，如果在培养前稀释液内没有活细胞繁殖，不会产生显示荧光的增加，此份稀释液计为“-”。

⑥利用稀释倍数、稀释液份数和每一次稀释的正得分数进行MPN计算。

简单理解SDC-MPN检测法，就是在压载水一系列的稀释过程中，找出活体可繁殖浮游植物的消失点，进而反推出原始压载水样品中活细胞的数量。例如：如果可繁殖的活体细胞在10倍的稀释液中检测到，但在100倍的稀释液中未检测到，则原始样品必须具有10至100个可繁殖活体细胞。通过稀释倍数及MPN数学计算，可以确定更精确的结果[9]。

由于压载水中最小尺寸为10～50微米的水生物一般为浮游植物，浮游植物为自养生物，能够利用光能在其环境中从无机物中形成营养有机物质，进行繁殖，产生叶绿素。因此，SDC-MPN方法适用于压载水中10～50微米大小的可繁殖浮游植物的有效检测[10]。

（2）活体染色法

活体染色法（The Vital Stain Method）是使用适合监测细胞运动或定位的荧光素染色剂应用荧光显微镜来评估压载水样品中10～50微米大小的生物体的数量和状态的方法。

常用的荧光素有二乙酸荧光素染色剂（FDA，Fluorescein Diacetate）和5-氯甲基荧光素染色剂（CMFDA-5，Chloromethylfluorescein Diacetate），CMFDA是FDA的氯甲基衍生物，这类荧光素染色剂也称为“活细胞示踪剂”。FDA已经被研究人员使用了几十年，用于作为酶活性和活力的量度，包括细菌、硅藻、甲藻、绿藻、草本植物等，当荧光素染色剂被动进入细胞后，染色剂中的亲脂性基团就会被活细胞中的非特异性酯酶水解，生成不渗透的荧光产物在细胞膜内保留下来[11]。但并非所有的生物都能被FDA染色，荧光信号常常不一致，CMFDA与FDA具有相同的荧光光谱，结合使用可以弥补这些缺陷。经过CMFDA标记的细胞产生可发出绿色荧光的5-氯甲基荧光素，荧光非常稳定，且可分配至两个子代细胞中，进行细胞运动的多代追踪[12]。

活体染色法对于检测压载水中的活体水生物比较有效，可以区分出细胞是“活的（Live）”或“死的（Dead）”。

（3）流式细胞术

流式细胞术（FCM， Flow Cytometry）是一种利用流式细胞仪对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数、分析和分选的生物学技术。流式细胞术是医学、化学及电子计算机科学等高度发展并综合应用的高科技产物。先进的流式细胞仪可以高速分析成千上万微小颗粒及细胞并可同时测得一个细胞的多个参数，将具有指定特性的颗粒有效区分并隔离[13]。

流式细胞仪的工作原理是对悬浮在液体中细胞或微粒进行荧光标记，使其流过光学或电子检测器，通过荧光探测器捕获检测标记的荧光信号，并将荧光信号转换成不同强度的电脉冲信号，经计算机处理形成相应的点图、直方图和加三维结构图像进行分析，实现快速自动的细胞分选和收集。

流式细胞仪可以对压载水中的≥50微米与≥10微米且＜50微米可生存有机体（包括异样生物）的数目进行直接自动的评估，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。

三、压载水取样检测方法存在的不足

分析压载水检测方法存在的不足之前，需要明确目前迫切需要统一标准检测压载水的方法应具有哪些特点。从适用推广的角度分析应具有以下特点：一是要经济，检测过程不能过于昂贵；二是操作应相对简单，可以在全球范围内推广使用；三是短时间内即可获得检测结果，一般数小时，而不能是几天，甚至几周；四是现场可以检测，不能必须带到实验室才能得到结果，这也是最重要的一点。结合以上特点分析压载水检测方法存在的不足如下：

1.D-1压载水置换标准检测方法存在的不足

D-1置换标准的检测实施已久，技术方法也比较成熟，但仍存在不足，如：使用电导计和盐度计测量盐度法简便快捷，但是指标检测会受到温度、压力等外部因素的影响，以及港口水域盐度较高时存在无法检测的问题；使用CDOM含量分析法检测比较可靠，但对检测人员的素质要求较高，而且附着在压载舱内壁在压载水置换时无法排除的孢囊等有机体，会影响检测结果的正确性[14]。

2.D-2压载水处理标准检测方法存在的不足

（1）最可能数量连续稀释培养法存在的不足

SDC-MPN检测方法被广泛应用于浮游植物物种识别和计数已经超过50年，最近几年才应用于列举压载水内总存活浮游植物的个数。如前所述，该方法对于检测压载水内可繁殖浮游植物是比较有效的。SDC-MPN检测方法存在以下不足之处：一是对于不能进行人工培养繁殖的浮游植物以及异样生物无法检测；二是对于生长繁殖缓慢的浮游植物也很难检测；三是耗时比较长，一般需要24小时到数月之久，而且会受到季节不同的影响[15]；四是需要培养专业的技术人员。

需要注意的是在申请BWMS的USCG型式认可时，USCG不认可SDC-MPN检测法，而认可使用FDA/CMFDA活体染色法。原因在于USCG要求的压载水处理标准高于IMO处理标准。IMO压载水处理D-2标准计数的水生物为可繁殖新个体的水生物（Viable Organisms），而USCG的标准是活水生物（Living Organisms），SDC-MPN方法应用促进浮游植物增长繁殖来检测，无法对不繁殖“活的（Live）”的水生物计数，因此USCG不认可此方法[4]。

（2）活体染色法存在的不足

CMFDA与FDA相结合的活体染色法（The Vital Stain Method）对于分析压载水中的浮游生物（包括异养型生物）的确是较有效的方法。但此方法同样存在一些问题：一是不同物种之间的染色强度不同，使得混合组合的评价容易出错；二是受假阳性干扰，有些明亮物种的死细胞荧光性比暗物种的活细胞高，在区分活细胞时会产生错误；三是同样需要专业的技术人员，尤其在排除假阳性干扰时，对显微镜师确定荧光阈值的要求较高[16]。

（3）流式细胞术存在的不足

流式细胞术（FCM）是当代最先进的细胞定量分析技术之一，使用流式细胞仪对船舶压载水内有机体直接计数，既准确又可减少人工。不足之处是流体细胞计数成本比较高，且落后的国家和地区可能没有此技术，同样也需要专业的技术人员，全球推广使用存在一定的困难[17]。

压载水中最小尺寸≥10微米且＜50微米水生物的检测方法除了这几种以外，还有免疫荧光法及流式摄像机（根据叶绿素a和活体染色）检测等，但每种方法都有其局限性，人员资质水平、仪器准确度等也会影响这些检测结果的准确性。不同的压载水检测方法适用于不同原理的BWMS，MEPC71次会议通过的BWM.2/Circ.61推荐检测方法如表2所示。

四、结束语

压载水取样分析存在很大的复杂性和技术局限性，对于船上的压载水管理人员来说似乎更是无能为力。在IMO没有确定统一标准的检测方法之前，确定了“对先行者不处罚”的原则，但前提是必须可提供足够的文件证明满足不处罚的前提条件。美国对船舶压载水管理更为严格，要求安装BWMS的船舶在第一年强制要求进行两次压载水的取样分析，根据分析结果确定下一年的取样要求。因此，船上压载水管理人员应在全面了解压载水管理、具备专业的管理知识的基础上，严格执行压载水管理计划及BWMS厂家的操作说明书和技术说明书等，尽量使PSC检查停留在初始检查阶段。

表2 推荐压载水检测方法