促秸秆腐熟真菌筛选实验初报

刘可，王远宏，常若葵，刘慧芹，李二峰，张斌

(天津农学院 园艺园林学院，天津 300384)

土壤是土地资源的重要组成部分，是人类赖以生存的基本的和重要的自然资源。土壤真菌及其群落结构组成对生态系统可产生深远影响，对生态系统的平衡也具有重要作用。真菌是土壤微生物的主要组成部分，参与有机物质分解。

玉米秸秆在自然条件下腐解速度缓慢，时间从3个月到半年不等，若直接焚烧，不仅危害公众健康，还造成环境污染。为解决这一问题，各国学者进行了不懈努力，秸秆腐熟技术应运而生，其原理主要是利用真菌在高温(40～60 ℃)下有效分解作物秸秆中的木质素、纤维素和半纤维素[1]，使秸秆中所含的有机质及磷、钾等元素成为植物生长所需的营养，并产生大量有益微生物，刺激作物生产，提高土壤有机质，改善作物品质。当温度超过65 ℃时，真菌的活跃度降低，秸秆腐熟作用下降[2]。本实验从土壤中提取和鉴定真菌DNA，并将得到的真菌进行耐高温实验和纤维素降解实验，旨在筛选出可用于秸秆腐熟的真菌菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

土壤中提取黑曲霉(Aspergillusniger)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、土曲霉(Aspergillusterreus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、青霉(Penicilliumsp. BAB-1995)等真菌，均保存于天津农学院植物病理实验室。

1.1.2 供试仪器

全自动高压灭菌锅(厦门致微)，HB.B11.600-S-Ⅱ恒温培养箱(上海跃进)，MJP-150霉菌培养箱(上海培因)，TGL-16台式高速冷冻离心机(湖南湘仪)，超净工作台(苏州安净)，梯度PCR仪(美国Bio-Rad)，智能恒温振荡器(德国Bottmingen)，电泳仪(日本Advance)，HNY-2102C立式摇床(天津欧诺)，恒温恒湿人工气候培养箱(德国Climacell)，电热恒温干燥箱(天津泰斯特)，精密电子天平(美国Ohaus)。

1.1.3 供试材料

PDA固体及液体培养基，用于真菌培养；纤维素酶鉴别固体培养基，用于纤维素酶测定。玉米秸秆样品，采集于天津市武清区及宝坻区。

1.2 方法

1.2.1 真菌收集

从天津、内蒙古、甘肃、山西、浙江、广西、贵州等地的发病作物根际采集土样，土样采回后于4 ℃冰箱中保存。将采集得到的土样置于室温风干，过60目筛后，取5 g土样，溶于100 mL的无菌生理盐水(1%，质量分数)中，28 ℃、200 r·min-1充分振荡30 min。取摇好的悬浊液，10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀释后分别涂布于PDA平板(每150 mL PDA加入100 μL硫酸链霉素，防止细菌污染)上，每个平板涂布200 μL，28 ℃倒置培养48 h，挑取真菌单菌落，进一步纯化培养。

1.2.2 真菌鉴定

将已长满真菌的平板，用无菌药匙刮下菌丝放置在灭菌的研钵中，加入适量液氮研磨成粉末状。用Solarbio公司真菌基因组DNA提取试剂盒(货号：D2300)提取真菌DNA，取1 μL DNA上清液作为模板，引物使用ITS1和ITS4，序列分别为5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3′。PCR体系(25 μL)：模板1 μL，dNTP 0.3 μL，10×缓冲液2.5 μL，引物(ITS1和ITS4)各1 μL，Taq酶0.15 μL，ddH2O 19.05 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，52 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，重复40次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

PCR所得产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程股份有限公司进行测序。将拼接序列在NCBI(美国国立生物技术信息中心)数据库上进行BLAST比对。

1.2.3 耐高温实验

将得到的31株真菌进行编号，用打孔器从真菌PDA平板重新转接真菌，置于45 ℃和50 ℃真菌培养箱中培养，每菌株设置3个重复，7 d内观察并记录生长情况，第7天进行拍摄记录。

1.2.4 纤维素酶实验

利用平板透明圈法[3]，取新鲜培养的真菌培养液，使用牛津杯分别接种到纤维素酶鉴别培养基平板上，42 ℃培养，定时观察真菌在培养基中的生长情况，以及透明圈的形成情况，同时测量透明圈直径，实验设置2个重复，取平均值。

1.2.5 秸秆腐熟实验

经上述实验，将筛选出的5株真菌制成PDA菌液。选取粗细与长度接近的完整玉米秸秆，将其截成3～5 cm小段。称取50 g秸秆小段放入40目尼龙袋中，编号，将样品置85 ℃烘干处理6 h，准确称量并记录每袋质量。将上述秸秆样品取出，放入方形玻璃器皿中，分别倒入前述5种样品菌液，同时设置清水对照(CK)，放在恒温恒湿人工气候培养箱内，温度设置为50 ℃，相对湿度70%，密封保存。分别在实验10、20、30 d取出处理样品，放置85 ℃烘箱中烘干6 h，准确称量并记录每袋质量。分别按10、20、30 d腐解时间计算秸秆失重率[4-5]。每处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 耐高温菌株筛选

将重新转接的31株真菌在MJP-150霉菌培养箱中32 ℃培养7 d，筛选出可以生长的真菌。将选出的真菌再次接种，在45 ℃和50 ℃培养箱中培养，第7天观察并记录生长情况。实验发现，只有14号、15号、23号、30号和37号菌株可以在50 ℃的高温下生长。其中，14号分离自天津北辰区核桃林，15号分离自内蒙古包头玉米地，23号和37号分离自河北沧州黄瓜田，30号分离自内蒙古草坪。

2.2 菌株的系统发育分析

取14、15、23、30、37号菌株进行测序、比对，结果显示，37号菌株与灰盖鬼伞蘑菇(Coprinopsiscinerea)亲缘关系较近，14号、15号、23号、30号菌株与烟曲霉(Aspergillusfumigatus)亲缘关系较近。37号菌株、14号菌株的系统发育分析结果如图1所示。

2.3 菌株的纤维素降解活性

如图2所示，14号、15号、23号、30号菌株在纤维素酶鉴别培养基中均能够正常生长，并形成透明圈，但4株菌产生的透明圈较小(表1)，且颜色较淡。4株菌中，14号和23号菌株可以使纤维素酶鉴别培养基颜色加深。

表1 各菌株在纤维素酶鉴别培养基上生长7 d的菌落直径及透明圈直径

2.4 菌株对秸秆的腐熟效果

2.4.1 秸秆腐解过程中的颜色变化

处理前玉米秸秆外观颜色都为青色。实验3 d可以看到明显的菌丝生长在秸秆表面；7～10 d秸秆明显变软，颜色变深，为黄褐色，而对照为浅黄色；20 d后秸秆数量变少，部分秸秆腐熟，成为褐色液体，并发出腐烂气味；30 d后，接种菌剂处理的秸秆颜色变为黑色，而对照为褐色。从表2可以看出，在相同时间内，接菌剂和未处理的秸秆颜色变化存在差异，接种菌剂的秸秆颜色变化比对照快，外观颜色变化为青色→黄褐色→褐色→深褐色→灰黑色，变化速度较快。

图1 37号与14号菌株的系统发育树

图2 各菌株在纤维素酶鉴别培养基上7 d的生长情况及形成的透明圈

处理施用前10 d20 d25 d30 d14青色黄褐色褐色深褐色灰黑色15青色黄褐色褐色深褐色灰黑色23青色黄褐色褐色深褐色灰黑色30青色黄褐色褐色深褐色灰黑色37青色黄褐色褐色深褐色灰黑色CK青色黄色浅黄色黄褐色褐色

2.4.2 秸秆腐解过程中的失重率变化

如表3所示，处理10 d，14号、15号、23号和30号的失重率无显著差异，均显著高于CK，但37号与CK间无显著差异。处理20 d，接种真菌菌株的各处理失重率均显著高于CK，接菌处理中，15号失重率最高，且显著高于30号和37号。处理30 d，接种真菌菌株的各处理失重率同样均显著高于CK，接菌处理中，以15号失重率最高，且显著高于其他处理。

表3 秸秆腐解过程中的失重率 %

3 小结

本研究初步筛选出5株能够腐熟秸秆的真菌菌株，分属于烟曲霉(Aspergillusfumigatus)和灰盖鬼伞蘑菇(Coprinopsiscinerea)。将各菌株与秸秆混合进行腐熟实验，发现来自内蒙古包头玉米地的15号烟曲霉(Aspergillusfumigatus)对秸秆的降解效果最好，经过30 d的培养观察，秸秆已基本降解，变得疏松，呈黑褐色或黑色，pH稳定在7.5左右。