高效液相色谱串联质谱法检测白术中井冈霉素残留

凌淑萍，王全胜，付岩，张亮，吴银良

(宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040)

井冈霉素(jingangmycin)是一种由吸水链霉菌井冈变种产生的水溶性抗生素——葡萄糖苷类化合物[1]，共有A、B、C、D、E、F六种组分，农业上应用的井冈霉素中，井冈霉素A的含量最高，约占60%；井冈霉素B约占15%，剩余部分为井冈霉素的其他组分[2]。井冈霉素为广谱抗真菌剂，具有良好的防治植物病害的作用，年产超过6万t，产值超过4亿元，可供近6 700亿m2农田使用[3]。通常作物中井冈霉素的提取可以通过甲醇与水(9∶1)溶剂提取，或通过10%氨水溶液提取；井冈霉素的初步提取液可通过固相萃取柱进行纯化。目前井冈霉素的定量法最低检出量可达到0.4 ng，平均回收率均超过70%，相对标准偏差(RSD)在1.1%～13.6%[4-8]。

中国是中医药的起源地，是中药材的生产和应用大国。白术为我国常用中药之一，为菊科植物白术的干燥根茎，性温，味甘、苦[9]，具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎的功效，用于治疗脾胃气弱、泄泻、汗出、胎动不安等。近年来，井冈霉素及其复配试剂常用来防治白术重要病害，如斑枯病，立枯病和白绢病等。目前国内外对井冈霉素报道比较少，中国、CAC、欧盟、美国及日本均未制定白术上井冈霉素的最大残留值。随着井冈霉素在白术上应用的普及，白术又是用于孕妇安胎的常见中药之一，建立合适的检测方法也变得尤为重要。本研究拟建立了一种在白术中井冈霉素残留量的检测方法，为有效监控井冈霉素在白术上的残留风险提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-MS/MS(Waters)、备色谱柱Acquity UPLC BEH C18(2.1×100 mm，1.7 μm)、恒温振荡器(IKA KS4000ic)、高速离心机(Sigma 3K15)、高速匀浆机(IKA T25)、旋涡混合器(IKA GENIUS3)、烘箱(STIK BAO-112A)、离心管、电子天平以及其他实验室常用仪器设备等。井冈霉素标准品86.4%，购自上海市农药研究所；乙腈、甲醇、乙酸铵为色谱纯；HLB SPE小柱购于Waters。

1.2 样品前处理方法

称取样品(白术鲜样5 g，白术植株和干样各4 g)置于50 mL离心管中，加入20.0 mL 90%甲醇水溶液，高速匀浆1 min后，9 500 r·min-1离心3 min，取上清液，残渣再加入10.0 mL 90%甲醇水溶液，高速匀浆1 min后，9 500 r·min-1离心3 min，合并2次上清液，在45 ℃条件下氮气吹至3 mL以下，待净化。

依次用6 mL甲醇、6 mL纯水活化6 mL HLB SPE小柱，将氮气吹过的剩余样品全部上样，再用4 mL纯水清洗试管，清洗液全部上样，收集所有流出液，用纯水定容至8.5 mL，再加入1.5 mL乙腈混匀，过0.22 μm滤膜后供LC-MS/MS测定。

1.3 标准溶液配制

标准储备液配制。将井冈霉素标准样品2.028 mg用纯水定容至25 mL，配制成70.09 mg·kg-1的母液，再用纯水稀释成10、1、0.1 mg·L-1浓度的标准样品，与4 ℃避光保存，有效期为6个月。

基质标准样品的配制。将白术植株、鲜样和干样空白样品按照1.3节的方法进行处理，得到3种空白基质溶液，再将母液分别配制成浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg·L-1的系列白术植株、鲜样和干样基质标准溶液。

1.4 分析测定

色谱条件。流动相为5 mmol·L-1乙酸铵、pH值4.5(A)和乙腈(B)。采用梯度淋洗，具体如表1。色谱柱柱温35 ℃，样品室温度10 ℃，进样体积10.0 μL。

表1 梯度洗脱条件

质谱条件。由表2可知，采用电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监测，电离电压2.50 kV，雾化气流速550 L·h-1，锥孔气流速50 L·h-1，源温150 ℃，雾化温度500 ℃。

表2 多重反应监测条件

注：*为定量离子。

2 结果与分析

2.1 标准曲线与灵敏度

将井冈霉素标样溶液用空白样品(基质)提取液稀释成不同浓度的标准基质工作溶液。在上述仪器条件下进样检测，井冈霉素的保留时间为0.7 min左右，得到MS响应值(峰面积，Y)与进样浓度(X)的线性回归方程。

白术植株基质。当井冈霉素进样浓度为0.01～1.00 mg·L-1时，二者呈线性关系，相关系数r为0.999 9，Y=6 044X-19。

白术基质(鲜样)。当井冈霉素进样浓度为0.01～1.00 mg·L-1时，二者呈线性关系，相关系数r为0.999 7，Y=9 314X-114。

白术基质(干样)。当井冈霉素进样浓度为0.01～1.00 mg·L-1时，二者呈线性关系，相关系数r为1.000，Y=8 071X-17。

综上所述，在白术鲜样、干样和植株基质中，当井冈霉素进样浓度为0.01～1.00 mg·L-1时，MS响应值与进样浓度线性关系良好。以根据标准曲线最低浓度0.01 mg·L-1、进样量10 μL计算，可得井冈霉素的最小检测量为1.0×10-10g。

2.2 添加回收率与相对标准偏差

按上述色谱条件及检测步骤，进行添加回收率试验，井冈霉素在白术植株、鲜样和干样中的添加浓度均为0.05～2.00 mg·kg-1，每个浓度重复5次。如表3所示，井冈霉素于白术植株中的平均回收率为85.5%～107.2%，相对标准偏差最大为7.2%；井冈霉素于白术鲜样中的平均回收率为95.4%～110.0%，相对标准偏差最大为5.9%；于白术干样中的平均回收率为82.4%～98.7%，相对标准偏差最大为8.1%。以最小添加浓度0.05 mg·kg-1作为最低检出浓度，因此井冈霉素在白术植株、鲜样和干样中最低检出浓度均为0.05 mg·kg-1。回收率和RSD均在农药残留试验准则允许范围内，方法重复性良好，可满足残留量分析要求。

表3 白术中井冈霉素的添加回收率

3 小结

本研究建立了一种白术上的残留分析方法，并对建立的方法进行了考察，包括线性、检出限、回收率和精密度等，能够分别对白术植株、鲜样和干样样品中的井冈霉素进行定性定量检测，方法快速、高效、灵敏，且能够满足农药残留分析的要求，为有效监控白术中井冈霉素提供可靠的技术支持。