蝉花虫草多糖脱蛋白研究

厉晓腊，陈官菊，方鸣，金轶伟，刘又高，王根锷，柴一秋

(浙江省亚热带作物研究所 温州市虫生真菌资源研究与开发重点实验室，浙江 温州 325005)

蝉花虫草(Ophiocordycepssobolifera)含核苷类、蛋白类、糖类、生物碱类、甾醇类等生理活性物质[1-5]，多糖是其中重要的一类。研究发现蝉花虫草多糖具有抗肿瘤、抑制免疫、增强免疫、抗氧化、抗衰老、护肝、降血压等药理作用[6-15]，对病毒、细菌、真菌等微生物具有抑制作用[15-17]。多糖往往是由多个相同的单糖基以糖苷键相连而成的高聚物，分子结构复杂，人工合成难，多从天然产物中提取制备。多糖制备过程中杂有许多干扰因子，如游离蛋白、酚类、蒽醌衍生物等色素物质，去除游离蛋白等干扰因子是多糖纯化的关键步骤。粗多糖脱蛋白的常用方法有Sevag法、蛋白酶法、三氯乙酸法、氯化钙法等，其中，Sevag法最为常用，其脱蛋白效果好且对多糖作用温和，但其采用的氯仿等试剂具毒性，对人和环境不友好[18-19]。发展于20世纪60—70年代的大孔吸附树脂，具有良好的分离兼脱蛋白、脱色等效果，且选择性广、吸附性佳、可再生，近十来年在多糖分离纯化中被广泛应用[20-24]。本试验采用大孔树脂吸附法和Sevag法相结合，开展蝉花虫草多糖去除蛋白研究，以期制备大量纯度较高的蝉花虫草多糖，为揭示蝉花虫草多糖的药理作用及推进蝉花虫草多糖研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株为人工栽培蝉花虫草子实体的优良菌株022007-9，该菌株由浙江省亚热带作物研究所植物保护与虫生真菌研究室分离获得，保存于中国微生物菌种保藏管委会普通微生物中心(CGMCC No:8989)。大孔吸附树脂AB-8，沧州宝恩吸附材料科技有限公司；牛血清白蛋白，sigma公司；苯酚、乙醇、氯仿、正丁醇、葡萄糖、硫酸、盐酸和氢氧化钠等试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 蝉花虫草粗多糖制备

蝉花虫草子实体采摘后，培养基残渣经70 ℃烘箱烘干，放入提取罐，按照培养基残渣质量与提取液体积比1∶10的比例加50%乙醇浸提液，加热至微沸状态，搅拌0.5 h，80 ℃左右保温2 h，过滤收集50%乙醇提取液，重复提取2次，合并2次提取液；第3次提取按照培养基残渣质量与提取液体积比1∶10加水提取，加热至沸腾，搅拌0.5 h，80 ℃左右保温1 h，过滤收集水提取液。50%乙醇提取液和水提液分别浓缩，浓缩液分别加3倍体积的95%乙醇，静置过夜，沉淀多糖。合并醇提浓缩沉淀部位和水提浓缩沉淀部位，喷雾干燥，即得到蝉花虫草粗多糖粉末。

1.2.2 脱蛋白处理

Sevag法脱蛋白：按5%质量分数用去离子水溶解多糖粉末，配制的多糖溶液与Sevag试剂(氯仿∶正丁醇体积比4∶1)按体积比5∶1混合均匀，剧烈振荡30 min，4 000 r·min-1离心15 min，置于分液漏斗分液除去中间变性蛋白层与下层有机溶液层。重复上述操作多次直至中间变性蛋白层不再出现为止，每次留样测定多糖和蛋白的含量。

大孔树脂法脱蛋白：选用弱极性大孔吸附树脂AB-8，装柱(柱径长50 mm×600 mm)。大孔树脂预处理与再生：先用95%乙醇浸泡12 h，用去离子水清洗至无乙醇味，用质量分数5%的盐酸溶液浸泡4 h，去离子水清洗至pH 6.0左右，再用质量分数2%的氢氧化钠溶液浸泡4 h，去离子水清洗至pH 8.0左右。将蝉花虫草粗多糖溶液上柱，依次用3倍柱体积的去离子水、20%乙醇和70%乙醇清洗，最后用95%乙醇清洗，洗脱液每250 mL收集1份，每份分别测定其多糖和蛋白含量。

1.2.3 多糖含量测定

采用中华人民共和国农业行业标准NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的测定》中的苯酚-硫酸法测定多糖含量。准确称取干燥至恒质量的无水葡萄糖100 mg，配制成0.1 mg·mL-1标准葡萄糖溶液，分别吸取标准葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加入20 mL具塞玻璃试管中，分别加蒸馏水至1.0 mL，再分别加入5%苯酚试剂1 mL混匀，然后垂直液面快速加入浓硫酸5.0 mL，静置10 min，混匀，30 ℃水浴反应20 min。紫外分光光度计(日本岛津，UV-2450)测定490 nm处的吸光度，以葡萄糖浓度和吸光度为横纵坐标绘制标准曲线。取合适浓度的样品溶液1 mL，按上述方法测定吸光度，再由回归方程计算其葡萄糖含量，在此基础上再乘以葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数0.90，即得样品的多糖含量。

1.2.4 蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[19]。配制牛血清白蛋白(BSA)标准溶液1 mg·mL-1，分别吸取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL标准BSA，添加蒸馏水至1.0 mL，充分摇匀，加入5 mL考马氏亮蓝G-250溶液，放置30 min，然后紫外分光光度计测定595 nm处吸光度。以D595对BSA作标准曲线。取合适浓度的样品溶液1.0 mL，按上述方法测定蛋白吸光度，再由回归方程计算其蛋白含量，计算蛋白去除率[24]。

2 结果与分析

2.1 粗多糖的提取得率

葡萄糖标准曲线的回归方程y=7.569 3x+0.012 3，R2=0.995 9，其中y为490 nm处的吸光度，x为葡萄糖浓度(mg·mL-1)。经苯酚-硫酸法检测，蝉花子实体培养基残渣用50%醇提沉淀部分多糖含量为44.7%，水提沉淀部分多糖含量为45.3%，蝉花子实体的培养基残渣中多糖得率约为14.2%。

2.2 Sevag法和大孔树脂法脱蛋白效果比较

蛋白标准曲线的回归方程y=5.325 7x+0.024，R2=0.990 4，其中y为595 nm的吸光度，x为牛血清白蛋白浓度(mg·mL-1)。从图1可知，蝉花虫草粗多糖经Sevag法脱蛋白1次，蛋白去除率约42%，脱蛋白2～6次，蛋白去除率变化不大，为82%～83%；再用大孔树脂吸附分离的水相部位还能去除剩余蛋白，蛋白总去除率约98%。蝉花虫草粗多糖先经大孔树脂洗脱，蛋白去除率约为86%，再用Sevag法脱蛋白1次，粗多糖的蛋白去除率达96%以上。说明Sevag法和大孔树脂法均能去除蝉花虫草粗多糖中的绝大多数游离蛋白，两种方法结合去除率更高，达96%以上。此外，大孔树脂吸附后的多糖颜色由棕褐色变为黄褐色，脱色明显。

A处理组，先用Sevag法对蝉花虫草粗多糖脱蛋白，再用大孔树脂法脱蛋白；B处理组，先用大孔树脂法对蝉花虫草粗多糖脱蛋白，再用Sevag法脱蛋白图1 蝉花虫草粗多糖Sevag法和大孔树脂脱 蛋白效果

2.3 蝉花虫草多糖的分离效果

A处理组，先用Sevag法对蝉花虫草粗多糖脱蛋白6次，再用大孔树脂法脱蛋白；B处理组，直接用大孔树脂法对蝉花虫草粗多糖脱蛋白。分别测定A处理组和B处理组的多糖和蛋白含量。从图2多糖含量变化曲线可知，A处理组和B处理组的蝉花虫草粗多糖均能分离获得水相部位和20%乙醇部位2个主要多糖显示峰，以及70%乙醇部位的一个多糖小峰，且分离的多糖峰型相似，表明是否进行Sevag法脱蛋白，对多糖组分影响不大，也表明Sevag法脱蛋白对多糖作用温和。从蛋白含量变化曲线(图2)可知，B处理组分离的蛋白组分较A处理组多、杂；重叠多糖和蛋白的变化曲线，可见两处理组分离的主要多糖组分都检测出少量蛋白，B处理组分离的多糖组分还明显杂有部分游离蛋白。表明用大孔树脂法去除粗多糖中的蛋白效果较好，但大孔树脂对不同蛋白和多糖的吸附程度不同，因此对与多糖吸附性相近的部分游离蛋白尚不能去除，而Sevag法能去除粗多糖中的大部分游离蛋白。

A，A处理组多糖含量变化曲线；B，A处理组蛋白含量变化曲线；C，B处理组多糖含量变化曲线；D，B处理组蛋白含量变化曲线图2 大孔树脂对蝉花虫草粗多糖的分离效果

3 小结

采用Sevag法和大孔树脂AB-8吸附法均能去除蝉花虫草粗多糖中的大部分游离蛋白，蛋白去除率达80%以上，其中Sevag法稍优于大孔树脂法。两种方法结合使用对蝉花虫草粗多糖中蛋白去除效果更为理想。先用Sevag法后用大孔树脂法，或者先用大孔树脂法后用Sevag法，就大孔树脂水相洗脱部位多糖的分离而言，蛋白去除率均达96%以上。大孔树脂还具有较好的分离效果和脱色效果，初步分离获得水相部位和20%乙醇部位的蝉花虫草多糖，多糖组分中检测到少量蛋白的重叠峰，推测这两个多糖组分中存在糖蛋白。综合分析，蝉花虫草粗多糖脱蛋白工艺采用先经Sevag法脱蛋白2～3次，再用大孔树脂AB-8吸附分离，或先大孔树脂AB-8吸附分离获得不同多糖组分，再用Sevag法辅助脱蛋白1～2次为佳，两种组合处理均能达到理想的去除蛋白和多糖初步分离效果。

粗多糖脱蛋白除杂工艺对下一步多糖高效分离纯化至关重要。Sevag法是一种认可的多糖脱蛋白常用方法，蝉花虫草粗多糖单独采用Sevag法脱蛋白一般须进行6～7次重复操作，中间变性蛋白层才基本不见，但操作人员易受Sevag试剂危害[18]。Sevag法和大孔树脂吸附法组合使用可以减少Sevag法脱蛋白次数及Sevag试剂用量。此外，大孔树脂AB-8价格低廉，可反复再生多次使用，成本低，洗脱溶剂乙醇毒性也低，而且大孔树脂吸附柱一次性处理能力较大，两种方法结合有利于获得大量的纯度较好的蝉花虫草多糖，可为多糖的进一步分离纯化及其生理活性功能研究打下良好的基础。