王梓楠,方浩泰,袁 青
(广州中医药大学针灸康复临床医学院,广州 510006)
良性前列腺增生症(benign prostatic hyperplasia,BPH)是中老年男性最为常见的泌尿外科疾病之一。BPH的普遍性高,发病率随年龄的增长逐渐上升。有文献报道[1],40~49岁群体BPH的发生率13. 8%,50~79岁群体BPH的发生率接近40%,80岁群体BPH的发生率超过80%,严重影响老年男性的生活质量。临床以尿三针为主,根据脏腑经络辨证配以相应配穴治疗BPH具有显著疗效。目前,针刺治疗BPH的临床观察研究颇多,肯定了针灸治疗BPH具有显著疗效,这些研究多采用西药治疗作为对照组进行研究。如陈雷[2]等将针灸治疗BPH与口服西药进行对比,认为针灸治疗疗效优于口服盐酸特拉唑嗪片。魏旭[3]等通过对针灸治疗前列腺炎临床文献的研究,使用频率最高的穴位与尿三针完全一致。本文旨在通过观察尿三针对前列腺增生大鼠的前列腺湿重、前列腺指数(PI)、组织形态、前列腺细胞凋亡情况的影响,从细胞凋亡角度对尿三针治疗BPH的相关机制进行探讨,阐述针灸治疗BPH的内在机制,为临床针刺治疗BPH提供理论支持。
成年雄性SPF级SD大鼠18只,体质量(270±20)g,由南方医科大学实验动物中心提供(质量合格证号SCXK(粤)2016- 0041),饲养于广州中医药大学青蒿研究所。
丙酸睾酮注射液(1 ml:25 mg)购于上海通用药业股份有限公司(批号131208);Tunel染色试剂盒购于罗氏公司(Roche,货号11684817910);苏木素染液和伊红染液购于碧云天公司。
倒置荧光显微镜由日本尼康公司生产(型号NIKON ECLIPSE ci-l);成像系统(Nikon DS-U3);光学显微镜由日本尼康公司生产(型号NIKON ECLIPSE ci);成像系统(Nikon digital sight ds-fi2)。
1.4.1 动物分组 将18只大鼠标记称重后,随机区组分为正常组、模型组、尿三针组3组各6只。
1.4.2 模型制备 模型组与尿三针组皮下注射丙酸睾酮5 mg/kg·d,连续28 d;正常组皮下注射相应体积的橄榄油,连续28 d,大鼠每天注射前称重计算注射药物量。
1.4.3 干预方法 造模完成后第1天即进行干预,将大鼠仰卧固定在固定器上,使用0.18×10 mm一次性无菌针灸针(华佗牌,苏州,中国),尿三针组针刺尿三针穴组,关元向下斜刺3 mm,中极向下斜刺3 mm,三阴交直刺3 mm,留针15 min,各穴每5 min捻转1次,每日1次,连续21 d,模型组与正常组固定相同时间。
1.4.4 前列腺指数测定 于末次干预后,禁食12 h,称空腹大鼠体重后以7%水合氯醛按0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉,大鼠麻醉成功后将其固定在手术台上,手术完整摘取前列腺组织,去掉周围脂肪组织。用电子天平精确测量前列腺湿重,计算大鼠前列腺指数:PI=前列腺湿重mg/大鼠体质量g。
1.4.5 tunel染色法检测凋亡细胞 10%福尔马林固定大鼠前列腺,石蜡包埋、切片。石蜡切片脱蜡至水,滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K储存液用PBS1∶9稀释)覆盖组织,37℃温箱孵育30 min。将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。切片稍甩干后滴加破膜工作液覆盖组织,常温下孵育20 min,将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2∶29混合,滴加覆盖组织,切片平放于湿盒内,37 ℃水浴锅孵育2 h,湿盒内加少量水保持湿度。切片用PBS(pH7.4)洗涤3次,每次5 min。去除PBS后滴加DAPI染液,避光室温孵育10 min。玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5 min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片,切片于倒置荧光显微镜下观察并采集图像。结果DAPI染的细胞核在紫外线激发下为蓝色,Roche试剂盒为FITC荧光素标记,阳性凋亡细胞核为绿色。应用Image-Pro Plus 6.0软件选取标记相同的绿色荧光细胞核作为判断所有照片阳性细胞的统一标准,选取标记相同的DAPI蓝色细胞核为其他细胞,对每张照片进行分析得出每张照片阳性细胞数以及总细胞数。计算大鼠前列腺细胞凋亡率:凋亡率=阳性细胞数/总细胞数×100%。
1.4.6 HE染色法观察前列腺组织形态 石蜡切片脱蜡至水,切片放入Harris苏木素染3~8 min,用自来水冲洗,1%的盐酸酒精分化数秒,再用自来水冲洗,0.6%氨水返蓝,流水冲洗。切片放入伊红染液中染色1~3 min,将染色后的切片脱水后用中性树胶封片,切片于尼置荧光显微镜下观察并采集图像。结果细胞核等碱性物质染为蓝紫色,细胞质及分泌物等酸性物质染为粉红色。
实验动物大鼠共18只,全部进入结果分析,无脱落。
表1显示,与正常组比较,模型组和尿三针组前列腺湿重及前列腺指数升高(P<0.05);与模型组比较,尿三针组前列腺湿重及前列腺指数明显降低(P<0.05)。
图1显示,正常组大鼠前列腺上皮为单层柱状或立方状,腺上皮细胞排列整齐,细胞核位于基底部呈圆形,腺腔规则平整,腺腔内充满大量粉红染酸性分泌物,无纤维组织增生。模型组大鼠前列腺上皮细胞为高柱状呈簇状增生,排列紧密,细胞核变大呈圆形或椭圆形,可见腺上皮细胞增生向腺腔内形成凸起,腺腔变小甚至关闭,腺腔内无粉红染酸性分泌物,有大量纤维组织增生。尿三针组大鼠前列腺上皮为柱状,少量为高柱状,部分排列整齐,细胞核呈圆形;腺上皮细胞增生向腺腔内形成少量凸起,腺腔轻度变小,腺腔内有粉红染酸性分泌物稍减少,有少量纤维组织增生。
表1图2显示,尿三针组的凋亡率明显高于正常组与模型组(P<0.05);模型组与正常组凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。
表1 各大鼠前列腺湿重、前列腺指数及细胞凋亡情况比较
注:与正常组比较:aP<0.05;与模型组比较:bP<0.05
图1 使用HE染色观察各组大鼠前列腺组织形态(HE×100)
图2 使用tunel染色法观察个小组前列腺细胞凋亡情况(tunel×200)注:白色箭头所指为凋亡细胞
BPH是由于前列腺间质和腺体的增生而导致解剖学上前列腺体积增大、压迫尿道,使尿道变形、狭窄,从而产生下尿路症状和膀胱高压等尿动力学改变。膀胱压力升高可导致膀胱、逼尿肌不稳定或失代偿状态,形成尿潴留甚至导致肾积水等继发病症[4-5]。BPH为老年性疾病,年老体弱或房劳伤肾,肾气不足,命门火衰,致使膀胱气化无权。现代人饮食不节易伤脾胃,后天脾胃运化水湿能力减弱;小肠失养则分清泌浊功能不足,浊液不能下输尿道;肝主疏泄,疏泄不及则水液不出。肝脾肾调节功能下降与小肠分清泌浊功能不足是造成BPH的重要原因。
根据BPH的中医病因病机,靳三针通过传统针灸理论选取中极、关元、三阴交组成尿三针。中极为膀胱募穴,可调节膀胱气化功能;关元为小肠募穴、足三阴经与任脉的交会穴,可调理小肠分清泌浊功能;中极、关元合用可调节尿液的生成、储存与排泄。人体水液代谢的调节离不开肝脾肾的功能正常,故选取足三阴经交会的三阴交。三穴合用共同主持水液代谢的调节,促进膀胱气化排出尿液,三穴合用体现了传统针灸大道至简的特点。临床上运用尿三针为主治疗老年性夜尿、尿潴留、尿失禁等各种泌尿系统疾病具有良好的疗效[6-8]。
成功建立模型是实验成功的关键。此前BPH模型的制备大多采用去势皮下注射丙酸睾酮的方法,此方法去除大鼠睾丸,打破了大鼠体内雌/雄激素水平的生理性平衡,雄性激素分泌减少,雌激素占据主导。研究表明[9],雌激素相对性增高可导致代谢相关性的前列腺增生。本实验采用不去势皮下注射丙酸睾酮的方法建立动物模型,更有利于研究BPH的针刺治疗效果[10]。实验结果中模型组的前列腺湿重与前列腺指数均高于正常组,差异有统计学意义,提示造模成功。
成功建立的模型可见明显的前列腺间质和腺细胞增生[11]。研究证明[12],前列腺增生与腺体内的细胞增生和凋亡相关,尤其是与细胞凋亡减少关系更加密切。“细胞凋亡”的概念是Kerr等于1972年首次提出[13]。细胞凋亡是内环境稳定的一种必要机制,是由基因控制的细胞主动死亡,又称细胞程序性死亡。
本实验中,尿三针组的前列腺湿重与前列腺指数均低于模型组且差异有统计学意义,尿三针组的细胞凋亡率明显高于模型组和正常组,差异有统计学意义,说明尿三针能促进BPH模型大鼠的前列腺细胞凋亡,改善其增生情况。模型组的细胞凋亡率与正常组比较差异无统计学意义,在没有尿三针干预时,BPH模型大鼠的前列腺细胞凋亡率与正常组相同,说明尿三针组的细胞凋亡并非是病理条件下自体损伤的一种现象,而是在针刺干预下机体为更好地适应环境主动争取的一种死亡过程。HE染色观察前列腺组织形态的结果中,尿三针组组织形态较模型组明显改善,且接近正常组的前列腺组织形态,说明针刺尿三针能明显改善BPH模型大鼠前列腺组织的形态改变,减少纤维组织增生,促进腺细胞酸性分泌物的释放,具有修复前列腺功能的作用。
细胞凋亡在维持机体器官正常形态结构方面起十分重要的作用,在BPH的研究中是一个重要的研究方向。在成年后前列腺细胞的凋亡与增殖建立一个新的平衡,前列腺的体积大小维持在一定的值。50岁后由于细胞凋亡异常而导致前列腺体积开始增长[14]。Quiles[15]等研究指出,即使前列腺的体积增加了4倍,但其相比于对照组DNA的合成率仍然下降了约1/3,推测细胞凋亡异常导致BPH的可能性更高。已有研究表明,多种治疗BPH的药物可促进前列腺细胞的凋亡。潘恩山[16]的研究表明,益肾通胶囊能降低机体内Ki-67、Bcl-2/Bax、CD34表达水平,促进细胞凋亡;杨雪梅[17]等认为,阿克替苷能显著抑制前列腺增生,其机制可能是通过调节Bcl -2和Bax的表达,从而促进良性前列腺增生的细胞凋亡;朱帅[18]等研究认为,癃畅颗粒可以下调大鼠前列腺增生组织中Survivin的表达,促进细胞凋亡。细胞凋亡减少是BPH发生的重要原因,如何促进前列腺细胞凋亡是治疗BPH的关键。本实验说明,尿三针治疗前列腺增生的机理之一是促进前列腺细胞凋亡,从而使前列腺体积缩小、质量减轻,减轻前列腺炎症及纤维化,从而起到治疗作用。但尿三针促进细胞凋亡的分子机制仍需在下一步的实验研究中从分子及基因水平验证。