江苏油田污水处理系统中微生物群落结构及分布特征研究

吴伟林，杨 帆，孟章进，姜桂英，方 芝

（江苏油田石油工程技术研究院，江苏扬州 225009）

油田经长期注水开发，地层水中已形成了较为稳定的微生物群落，在低于100℃的较浅的地层中，微生物群落较为复杂，种类多且数量大，以细菌为主，主要包括石油烃降解菌、脱氮菌、产甲烷菌、硫酸盐还原菌、铁细菌、硫细菌和腐生菌等。这些细菌在地层环境长期生存的过程中，产生了较强的适应性[1]。这些微生物的存在对水质有很大影响，在油田水系统中尤以硫酸盐还原菌（SRB）、铁细菌（FB）和腐生菌（TGB）对水质的影响最大。

传统的富集培育、分离鉴定的生物学方法，只能获得生物的可培养部分，而这可培养部分仅占环境生物的百分之几，不同的生物还需要准备不同的培养基进行选择性培养[2]。用分子生态学研究方法可以更全面认识环境中的生物，从环境中提取总的生物分子DNA，利用PCR（聚合酶链式反应）技术，在特定引物作用下，将环境中存在的生物信息分子16S rDNA进行2n倍扩增（n=30～40），这些分子经过连接到质粒上转化进入感受态细胞中，培养、选取连接转换成功的细胞，并提取其中的生物信息分子16S rDNA，对其进行测序，再与基因库中的生物信息分子16S rDNA进行对比，确定科属或种属，即构建成环境样品的基因文库[3-7]。这种方法较费时，但对研究环境中存在的物种非常有用。另一种简便快速的生物技术方法是DGGE（变性梯度凝胶电泳），虽然得不到非常详尽的物种信息，但可以快速检测到生物的变化，对物种的部分信息也能有所了解。

本文用基因文库法对两个污水处理大站系统中的菌群进行普查，建立江苏油田回注污水的菌群基因组文库，并应用DGGE技术分析系统流程中细菌群落结构变化，为后续污水治理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器

高二联和杨家坝污水处理站系统水样；离心机；PCR扩增仪；变性梯度凝胶电泳仪。

1.2 实验方法

总DNA提取：将油田采集的样品摇匀，取1200mL～2 000 mL样品于离心杯中，5 000 r/min离心20 min，小心移除上清液。依次加入溶菌酶、氯仿处理，离心获得样品的总DNA。

PCR扩增：所得细菌总DNA，PCR扩增16S rDNA，琼脂糖电泳检测确认，加入特征引物PCR扩增16S rDNA V3区。

功能菌的选择性培养：根据油田腐蚀重要菌的特性，利用选择性培养基培养腐生菌、铁细菌及硫酸盐还原菌，提取其总DNA扩增16S rDNA中的V3区，同样进行DGGE分析，对照其他样品，确定相关细菌，软件测定各条带亮度，分析总生物量和重要细菌的相对量。

2 结果与讨论

2.1 油田水样的DGGE测定结果

图1 高二联和杨家坝污水处理站系统中细菌群落及分类菌DGGE

对采集的高二联和杨家坝区块12个样品，通过总DNA的提取，细菌群落的16S rDNA V3区选择性扩增，并进行DGGE检测，其结果（见图1，左图），并与选择性培养后的结果对比（见图1，右图）。从图1中可以看出各样品呈现不同的细菌分布特征，主体微生物较接近。其中样品3、4号细菌种类最丰富。3及4号合并建库。

2.2 污水处理系统中细菌分布特征

根据水样的细菌丰富情况，选择3号和4号水样合并构建细菌文库。由样品的总DNA通过连接和转化，构建了相应的文库，结果（见表1）。

由表1可知，样本中存在大量未培养的细菌，也存在 Geobacter lovleyi SZ，Desulfobulbus sp，Bacterium B1C2-1，Arcobacter sp.R-28214， 油田细菌，Pseudomonas stutzeri A1501，Bacteroides sp，Acholeplasma sp，Syntrophobacter sulfatireducens，Desulfobulbus propionicus，Desulforegula conservatrix，Wolinella succinogenes，Firmicutes bacterium 及 Trichlorobacter thiogenes等。主要的硫酸盐还原菌为Desulfobulbus和Desulforegula。

表1 江苏油田采集样品3号和4号水样的细菌文库

表1 江苏油田采集样品3号和4号水样的细菌文库（续表）

其相对丰度（见表2）。

从表2可以看出，油田中以未培养的细菌为主，占总体的近40%，其次是罗氏地细菌和硫酸盐还原菌分别约占16%，假单胞菌约占7%，端细菌及琥珀菌分别约占5%，其他如细菌，共生菌，三氯菌及盐沼菌等各约占2%。根据油田功能菌（腐生菌、硫酸盐还原菌及铁细菌）分，腐生菌约占44%，硫酸盐还原菌约占16%，铁细菌＜2%，未培养其生理生化特性不明的微生物占40%。

根据文库的细菌检测到的丰度及DGGE条带亮度的联系，利用凝胶分析系统进行半定量，分析两个污水处理系统中细菌量及群落变化或分布，结果（见表3，表 4）。

高集污水系统中油井微生物较多，处理后逐步降低，注水井中微生物又高了；假单胞菌油井中较多，处理后降低至消失；未培养菌及硫酸盐还原菌为主体。油井中高6-58的硫酸盐还原菌（细菌量指数1 203）较高6-65的硫酸盐还原菌（细菌量指数700）高；地细菌油井中仅在高6-58存在，处理流程中逐步减少；端细菌在油井高6-65中较高，流程中仅在高二联60 m3缓冲罐出口检测到；沃氏琥珀菌仅在油井高6-58中检测到；处理流程中高二联三相分离器出口硫酸盐还原菌（细菌量指数2 161）最高，依次减少缓冲罐出口硫酸盐还原菌（细菌量指数1 337），高二联注水泵进口硫酸盐还原菌（细菌量指数1 353）。

杨家坝污水处理系统中，处理流程中细菌量较高，随处理过程而减少，种类较少，仍然以未培养菌及硫酸盐还原菌为主体。该系统中，假单胞菌、地细菌、端细菌及沃氏琥珀菌几乎没有，仅在杨家坝注水泵进口检测到不足10%的地细菌。

油井中硫酸盐不同，卞东中转站硫酸盐还原菌（细菌量指数3 598），郭塘中转站硫酸盐还原菌（细菌量指数1 544），闵18中转站硫酸盐还原菌（细菌量指数3 150），处理流程依次增加，杨三相分离器出口（硫酸盐还原菌细菌量指数3 567），高100 m3沉降罐出口（硫酸盐还原菌细菌量指数4 681），杨家坝注水泵进口（硫酸盐还原菌细菌量指数4 737）。

表2 检测到的细菌相对丰度

表3 高集污水处理系统细菌群落分布

表4 杨家坝污水处理系统细菌群落分布

按油田功能分类细菌的结果（见表5）。

由表5可知，高集和杨家坝区块污水中以腐生菌为主，其次是硫酸盐还原菌，铁细菌相对较少。值得注意的是，在卞东中转站水样中铁细菌较多，硫酸盐还原菌未检测到；高6-65水样中，铁细菌较硫酸盐还原菌多。

3 结论

（1）用基因文库法对高二联和杨家坝污水处理站系统中菌群进行普查，建立了回注污水的菌群基因组文库，发现水样中以未培养的细菌为主，占总体的近40%，其次是罗氏地细菌和硫酸盐还原菌分别约占16%，假单胞菌约占7%，端细菌及琥珀菌分别约占5%，其他如细菌，共生菌，三氯菌及盐沼菌等各占约2%。根据油田功能菌（腐生菌、硫酸盐还原菌及铁细菌）分，腐生菌占约44%，硫酸盐还原菌占约16%，铁细菌占＜2%，未培养其生理生化特性不明的微生物占40%。

（2）通过DGGE分析发现，高二联集输系统中铁细菌增加，而SRB减少。杨家坝集输系统中，铁细菌和SRB均增加。铁细菌在高二联集输系统中比杨家坝集输系统中多，而SRB在杨家坝集输系统中比高二联集输系统多。

表5 油田水系统中分类菌的分布情况

（3）通过基因文库法和DGGE技术对污水处理站系统中菌群分析，有利于了解污水处理系统中细菌种类和分布情况，特别是油田常见危害菌（SRB、TGB、FB）的分布，为后续治理细菌起到指导作用。