Ad-HGF对老龄高血压高血脂大鼠炎症因子IL-10、NF-κBp65表达的影响

郭寒冰 焦长林 孙允芹 李 彤

(新乡医学院第一附属医院神经内科，河南 卫辉 453100)

近年来，人肝细胞生长因子重组腺病毒(Ad-HGF)作为一种新型基因定植药物，在血管新生方面的作用引起广泛关注，目前研究发现Ad-HGF有促进脑血管新生的作用〔1〕。随着人们生活水平的提高，高血压高血脂成为老年人各种疾病的导火索。本研究观察向老龄高血压高血脂大鼠枕大池内注射Ad-HGF后大鼠脑组织炎症因子白细胞介素(IL)-10及核因子(NF)-κBp65表达的变化，验证外源性Ad-HGF作用于老龄高血压高血脂大鼠脑组织的安全性。

1 材料与方法

1.1主要的试剂和仪器 实时荧光定量PCR仪(新加坡，Life Technologies)；Ad-HGF(滴度5×109pfu/100 μl，北京奥洛英)；微量注射器；高脂饲料(胆固醇、丙基硫氧嘧啶、胆酸钠、蛋白粉、蔗糖、蛋黄粉、猪油)；大鼠脑立体定位仪(淮北，正华)；大容量离心机(德国，Hettich)；一抗抗体兔抗鼠IL-10抗体(武汉博士德，BA1201-1)；一抗抗体兔抗鼠NF-κBp65抗体(万类生物，WL01980)；IL-10上游引物：5′-CAG TCA GCC AGA CCC ACA T-3′，下游引物：5′-GCT CCA CTG CCT TGC TTT-3′，片段长度141 bp；NF-κBp65上游引物：5′-GGC AGC ACT CCT TAT CAA C-3′，下游引物：5′-GGT GTC GTC CCA TCG TAG-3′，片段长度247 bp。

1.2实验动物 雄性Sprague Dawley大鼠，120只，250～300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供〔SCXK(京)2012-0001〕，12 h明暗交替，饮水摄食自由。随机分为假手术组、老龄高血压高血脂大鼠模型组、老龄高血压高血脂模型组枕大池注入Ad-HGF后10 d组、20 d组、30 d组各20只。

1.3实验模型制备 使用10%水合氯醛麻醉大鼠后固定，腹正中线偏左肋弓下缘2 cm处切开，找到左肾静脉，剥离并用血管线穿过肾静脉，同时放入约1.5 cm的针灸针，将线打结后拔出，用同样的方法行右肾静脉狭窄术，术后闭合腹腔。普通饲料喂养2 w后，测量大鼠血压(剔除不符合检验指标大鼠11只)，观察到模型组血压明显增高。高血压造模成功后高脂饲料喂养(0.2%丙基硫氧嘧啶，2%胆固醇，5%猪油，0.25%白糖，0.35%胆酸钠)16 w。高血脂造模成功标准：抽取大鼠静脉血测得血脂升高，取大鼠颈内动脉行苏木素-伊红(HE)染色，观察到颈内动脉血管内皮细胞排列紊乱，有粥样斑块形成。假手术组分离左右肾动脉，不行肾动脉狭窄术，术后正常饲料喂养。造模完成后，假手术组通过枕大池注入生理盐水，老龄高血压高血脂模型组大鼠通过枕大池注入生理盐水，注药后10 d、20 d、30 d组为模型组大鼠通过枕大池注入Ad-HGF(10 μl，滴度5×109pfu/100 μl)后分别于第10天、20天、30天处死。

1.4血压、血脂浓度测定 使用ML125/R制备的鼠尾套测得假手术组与模型组血压，发现模型组血压明显升高，证明高血压模型建造成功，抽样抽取假手术组与模型组大鼠尾静脉血，测量血清中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量，发现血清TC、TG、LDL-C明显增高，而HDL-C明显降低，证明高血脂模型建造成功。

1.5免疫组织化学标本制备 10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后暴露心脏，从心尖部插入粗针头使针头到达主动脉弓，同时剪开右心耳使静脉血流出，心脏灌注观察直到有清亮液体流出，随后4%多聚甲醛灌注固定组织，快速分离完整脑组织放入多聚甲醛固定液，于24 h后制作蜡块，石蜡切片机切取3 μm厚的脑片。

1.6免疫组织化学法检测IL-10、NF-κBp65阳性细胞表达 脑片经过二甲苯脱蜡、枸橼酸钠微波修复、Triton增加膜的通透性、加入一抗4℃在湿盒中过夜、二抗、二氨基联苯胺(DAB)显色等步骤得到免疫组织化学阳性表达结果。

1.7实时荧光定量PCR检测IL-10、NF-κBp65 mRNA的表达 10%水合氯醛麻醉，快速取出脑组织，液氮罐预冷后-80℃冰箱保存。研钵中倒入液氮，研磨组织成粉，Trizol法提取总的RNA进行实时荧光定量PCR。目的基因相对表达量采用2-△△CT进行分析。

1.8统计学方法 运用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1大鼠一般状态 模型组大鼠表现为精神萎靡、毛发无光泽、活动迟缓、体重升高。经枕大池注入Ad-HGF后精神状态改善、饮食良好。

2.2大鼠体重及血脂变化 与假手术组相比，模型组收缩压(SBP)明显升高(P<0.05)，说明双侧肾动脉狭窄术所导致的高血压模型建造成功，模型组TC、LDL-C、TG水平显著增加，HDL-C水平显著减少，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表1。

表1 假手术组与模型组SBP及血浆脂蛋白比较

与假手术组比较:1)P<0.05

2.3各组海马CA1区IL-10、NF-κBp65阳性细胞数比较 免疫组织化学结果显示，假手术组有少量IL-10表达，而模型组显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，注药后10 d组显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，且注药后20 d组达到高峰，注药后30 d组开始呈下降趋势。与假手术组相比，模型组NF-κBp65表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，注药后10 d、20 d组呈递减趋势(P<0.05)，注药后30 d组与20 d组差异无统计学意义(P>0.05)，见图1，表2。

图1 各组大鼠海马CA1区IL-10、NF-κBp65阳性细胞数(免疫组化染色，×200)

表2 各组大鼠海马CA1区IL-10、NF-κBp65阳性细胞数比较个/HP,n=10)

与假手术组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05；与注药后10 d组比较:3)P<0.05，同表3

2.4各组大鼠海马区IL-10、NF-κBp65 mRNA表达 与假手术组比较，模型组IL-10 mRNA表达显著减少，而NF-κBp65 mRNA表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，注药后10 d、20 d、30 d组IL-10 mRNA表达显著增加，NF-κBp65 mRNA表达显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠海马IL-10、NF-κBp65 mRNA表达比较

3 讨 论

肝细胞生长因子(HGF)具有强烈的促进血管新生的作用〔1～4〕，而没有组织水肿、低血压等问题〔5〕。临床研究发现，HGF可以改善心肌缺血〔6〕，增加IL-10的表达，对心脏组织没有明显的毒性和诱变作用〔7〕。同时，HGF可以抑制由于脑组织损伤而产生的纤维化〔8，9〕，缓解由于脑供血不足导致的各种临床症状及后遗症。研究发现，将带有HGF的野生型病毒(HVJ)注入大鼠蛛网膜下腔后脑部新生血管明显增多〔10〕。

随着HGF被广泛研究，我国构建了具有专利技术的Ad-HGF，它是一种新型的基因定植药物(腺病毒载体为E1、E3缺失体)，避免了野生型腺病毒的复制产生〔11〕。新型药物Ad-HGF的研发及其对组织缺血的疗效〔12〕，使其在高血压高血脂所造成的缺血性脑血管病中的应用得以关注。但由于脑组织结构的特异性，需要通过检测药物进入脑组织后炎症因子的表达，推测药物作用于脑组织的安全性。本文通过建造老龄高血压高血脂大鼠模型〔13〕，建立稳定的与高龄人群高血压高血脂导致的脑缺血相似的病理改变。成功建立模型后，通过枕大池注入Ad-HGF，使HGF进入脑脊液循环中发挥作用。本研究结果表明，向大鼠枕大池注入Ad-HGF后，大鼠脑组织抗炎的炎症因子IL-10水平升高，而NF-κBp65水平降低。

研究证明，IL-10〔14〕在动脉粥样硬化中占据重要位置，调节T细胞增殖，抑制促炎的炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6等的炎症反应〔15〕，可以缓解动脉粥样硬化的进展并促进组织损伤的愈合。而NF-κBp65〔16〕为NF-κB进入细胞核中的一个亚基，p65转位至细胞核后会增强受损组织的炎症浸润，且参与神经细胞凋亡机制〔17〕。本研究结果说明药物注入脑组织后减少炎症反应，促进了由于高血脂高血压造成的大鼠脑组织的损伤修复。

有研究显示〔18〕，将Ad-HGF重复注入大鼠心脏衰竭模型的心肌组织中，新生血管密度明显增加、心脏功能明显改善。因此，计划采用反复多次的注药方式延长药物作用时间，同时将从大鼠生存周期、记忆力等方面继续验证Ad-HGF对于脑组织作用的安全性。