多重荧光定量PCR方法在呼吸道合胞病毒和腺病毒检测中的Meta分析

赵莉 李贵霞 赵民 王佶 张瑞卿 冯志山 马学军

050031石家庄,河北医科大学(赵莉、张瑞卿);050031石家庄,河北省儿童医院(李贵霞、冯志山);053500景县,河北省景县人民医院(赵民);102206北京,中国疾病预防控制中心病毒病所(王佶、张瑞卿、马学军)

呼吸道感染是一类常见的疾病，80%以上病例由病毒引起，它在婴幼儿、儿童、老年人、免疫力低下的人群中有极高的发病率和死亡率[1-3]。引起呼吸道感染的常见病毒主要有呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、腺病毒(adenovirus，ADV)、副流感病毒(parainfluenza virus，PIV)、人鼻病毒(human rhinovirus，HRV)、流感病毒(influenza virus，IFV)[1，4]，其中 RSV 和 ADV 分别是呼吸道RNA病毒和DNA病毒中较常见的病毒[5]。

近些年来，分子生物学检测技术不断发展，其中实时荧光定量PCR(qRT-PCR)具有高灵敏度、高特异性且操作简便等优点[6]，多重实时荧光定量PCR(multiplex real time polymerase chain reaction，MRTPCR)技术能够实现高通量检测，在qRT-PCR优点的基础上又节省了成本、减少了工作量[7]。为科学评价MRT-PCR方法检测呼吸道病毒的价值，为临床应用提供参考，本研究对MRT-PCR检测呼吸道感染中常见的RNA病毒(RSV)和DNA病毒(ADV)进行了Meta分析。

1 材料与方法

1.1 文献纳入标准和排除标准 文献的纳入标准:(1)研究类型为诊断性研究。(2)研究目的为评价MRT-PCR方法对呼吸道病毒的诊断价值。(3)中文和英文文献。(4)文献能直接或间接提供原始数据获得四表格数据:真阳性值(true positive，TP)、假阳性值(false positive，FP)、假阴性值(false negative，FN)、 真阴性值(true negative，TN)。 排除标准:(1)重复发表的文章。(2)无全文的文章。(3)用MRT-PCR方法作为唯一的参考标准去评估其它的MRT-PCR的文章。(4)研究例数＜30例。(5)重要数据报告缺失。除此之外，我们排除学位论文、文摘、综述、讲座和述评类文献。

1.2 检索策略 计算机检索美国国立医学图书馆PubMed数据库、荷兰医学文摘 EMBASE数据库、Cochrane临床试验数据库、万方数据库、CNKI数字图书馆。检索时间限定为2010年1月至2018年1月。 英文检索词包括:multiplex，real time，quantitative，pcr，polymerase chain reaction，respiratory virus，respiratory tract infection， respiratory infection，respiratory tract disease， respiratory disease， common cold， influenza， pneumonia， bronchitis， bronchiolitis，rhinosinusitis， pharyngitis， laryngitis， otitis media，tonsillitis， asthma， copd， chronic obstructive lung disease。中文检索词包括:多重荧光定量PCR，呼吸道病毒。

1.3 文献筛选、数据提取和质量评价 由本研究中的两名人员分别独立提取数据，如出现意见不一致时，征求第三方专家解决。所有文献信息录入Excel数据库，录入信息包括:作者、发表年、国家、研究例数、年龄范围、呼吸道病毒检测的参照方法、计算灵敏度、特异度所需的四格表数据，纳入文献的检测限。采用诊断准确性研究的质量评价工具QUADAS-2[8](quality assessment of diagnostic accuracy studies-2)对所纳入研究的方法学质量及偏倚风险进行评价，包括病例的选择、待评价试验、金标准、病例流程和进展情况4部分。

1.4 统计学方法 本研究采用Meta-Disc1.4软件进行异质性检验和合并统计量分析，使用Stata 12.0软件进行发表偏倚检测。首先采用spearman相关分析检测有无阈值效应的存在。进而用I2评估所纳入原始研究间的异质性。当P＞0.1，I2≤50%(I2反映了研究间变异占总变异的百分比)时采用固定效应模型，否则认为存在异质性，采用随机效应模型对各诊断指标进行汇总处理。诊断评价指标主要包括:敏感度(sensitivity，sen)、特异度(specificity，spe)、阳性似然比(positive likelihood ratio， +LR)、阴性似然比(negative likelihood ratio，-LR)、诊断优势比(diagnostic odds ratio，DOR)、综合受试者工作特征(summary receiver operating characteristics，SROC)曲线下面积(area under curve，AUC)和 Q指数，同时计算相应的95%CI值。发表偏倚采用Deek检验完成。检验水准均设为α=0.05。

2 结果

2.1 文献检索结果 根据指定的检索策略共获得相关文献2 113篇，经逐层筛选，按照排除标准排除不符合要求的文献，最终获得10篇评估MRT-PCR方法检测呼吸道合胞病毒和腺病毒感染的诊断价值的文献，共包括病例2 528例。文献的筛选流程和结果见图1。

图1 文献筛选流程图Fig.1 Flow diagram of the literature search

表1 纳入文献的基本信息Tab.1 Characteristics of 10 included studies

2.2 纳入研究的基本特征和偏倚风险评估 纳入的10篇文献中，纳入研究的基本特征见表1。本研究采用QUADAS-2工具进行偏移风险评价，结果显示主要风险来源于病例的选择部分，待评价实验、金标准、病例流程和进展情况大部分是低风险偏倚。

2.3 Meta分析结果

2.3.1 异质性检验:MRT-PCR检测RSV阈值效应检验结果为:计算灵敏度对数与 (1-特异度)对数的spearman相关系数 =0.596(P=0.069)；Meta-Disc1.4软件拟合的ROC曲线不呈“肩背状”，提示尚不能认为存在阈值效应。研究间敏感性和特异性的异质性检验结果显示P=0.00，I2=85.1%；P=0.00，I2=90.1%。纳入的MRT-PCR检测RSV的研究结果间存在异质性，且并非阈值效应引起。MRTPCR检测ADV阈值效应检验结果为:spearman相关系数=0.071(P=0.867)；Meta-Disc1.4软件拟合的ROC曲线不呈“肩背状”，提示尚不能认为存在阈值效应。研究间敏感性和特异性的异质性检验结果显示 P=0.00，I2=74.6%；P=0.00，I2=80.3%。 纳入的多重荧光定量PCR检测ADV的研究结果间存在异质性，且并非阈值效应引起。因此多重荧光定量PCR检测RSV和ADV感染均采用随机效应模型进行合并统计量分析。

2.3.2 合并效应量结果:随机效应模型Meta分析结果显示:MRT-PCR检测 RSV的 Sen合并，Spe合并，+LR合并，-LR合并分别为0.87(95%CI:0.83-0.90)、0.98(95%CI:0.97-0.98)、64.05(95%CI:18.84-217.68)、0.12(95% CI:0.05-0.26)， 见 图 2。DOR合并、AUC和 Q指数分别为919.76(95%CI:432.74-1954.89)、1.00 和 0.97。 MRT-PCR 检测ADV 的 Sen合并， Spe合并， +LR合并， -LR合并分别为0.64(95%CI:0.56-0.71)、0.99(95% CI:0.98-0.99)、107.16(95%CI:24.28-472.95)、0.19(95%CI:0.07-0.50)，见图3。 DOR合并、AUC和 Q 指数分别为 596.29(95% CI:222.77-1596.09)、0.99和0.96。

图2 MRT-PCR 检测 RSV 的 Sen合并(A)、Spe合并(B)、+LR合并(C)、-LR合并(D) 森林图Fig.2 Forest plot of total sensitivity(A)， total specificity(B)，total+LR(C)，total-LR(D)of MRT-PCR for detection of RSV

2.4 敏感性分析 敏感性分析通过逐一剔除研究例数较少的几篇文献，重新计算各合并统计量。结果显示，Sen合并、Spe合并、AUC 的改变都非常小，可以认为本研究结果稳定性较好。

2.5 发表偏倚分析 采用Stata12.0软件绘制Deek漏斗图，评估纳入研究的发表偏倚。对RSV和ADV进行评估，结果分别为t=-1.12，P=0.30；t=-0.06，P=0.95，P 值均大于 0.05，差异无统计学意义，提示存在发表偏倚的可能性较小。

图3 MRT-PCR检测 ADV 的 Sen合并(A)、Spe合并(B)、+LR合并(C)、-LR合并(D) 森林图Fig.3 Forest plot of total sensitivity(A)，total specificity(B)，total+LR(C)，total-LR(D)of MRT-PCR for detection of ADV

3 讨论

本研究共纳入2 528例病例样本，Meta分析结果显示MRT-PCR检测RSV的Sen合并和Spe合并分别为0.87和0.98，表明其在检测RSV中具有较高的特异度，但灵敏度有待进一步提高。通常+LR大于10或-LR小于0.1可以作为确定或排除疾病的诊断标准(确诊诊断)[17]。本研究中，MRT-PCR检测RSV的 +LR合并是64.5，表明 MRT-PCR对 RSV的误检率较低；-LR合并是0.12，表明在检测RSV为阴性时尚不能排除RSV为阳性的病例，提示不能排除漏检情况。本研究检测RSV的AUC和Q指标分别为1.00和0.97，AUC和Q指标都是同时考虑了灵敏度和特异度的综合指标，提示 MRT-PCR检测RSV的综合能力较好。DOR也是综合反映灵敏度和特异度的诊断效能指标，本研究中该值为919.76，说明MRT-PCR对RSV具有较好的检测能力。总之，MRT-PCR检测RSV的灵敏度有待进一步提高，检测综合能力较好。MRT-PCR检测ADV的 Sen合并和Spe合并分别为0.64 和0.99，+LR合并和-LR合并分别为107.16和0.19，AUC为0.99，Q 指数为 0.96，DOR合并为 596.29。 提示 MRT-PCR 检测ADV有极高的特异度，但灵敏度中等，误检率较低，漏检情况不能排除，但MRT-PCR检测ADV感染的综合能力较好。

综合来看，MRT-PCR检测呼吸道常见RNA病毒RSV和DNA病毒ADV感染的综合能力较好，但是其对RSV和ADV的漏检情况尚不能排除，灵敏度还有待进一步提高。通过将多种呼吸道病毒的引物和探针或者引物和荧光染料放到一管里进行检测，可能对其检测的灵敏度产生影响；此外本研究纳入的文献检测RSV和ADV的引物不完全相同，导致报道的检测灵敏度有差异。因此，MRT-PCR在检测呼吸道病毒感染时，其灵敏度还可以改善，但检测的综合能力较好。

本研究尚存在一些不足，首先，选择的文献都是公开发表的全文，未列入灰色文献，可能有一定的偏倚；其次，本研究结果存在一定的异质性，但由于纳入文献篇目有限未进行亚组分析；另外，纳入文献中评价MRT-PCR的参考方法存在一定差异，可能对评价结果有些影响；最后，本研究仅对呼吸道病毒感染较常见的RSV和ADV做了评价，在以后的工作中，将会进一步评价MRT-PCR对其他呼吸道病毒的检测效能。

总之，根据本研究结果，MRT-PCR对呼吸道常见病毒RSV和ADV的检测具有较高的特异度，对RSV和ADV的检测灵敏度还有待进一步提高，但MRT-PCR检测RSV和ADV的综合能力较好，值得推荐用于临床早期诊断呼吸道病毒RSV和ADV的感染。

利益冲突 无