2017—2018年安徽省乙型流感病毒病原学特征分析

何兰 何军 俞俊岭 龚磊 侯赛 朱梦 李卫东

230601合肥,安徽省疾病预防控制中心

近年来流感病毒对人类健康的危害已经越来越引起关注，因为随着全球化趋势的日益明显，某一地区的季节性流感爆发常常会对全球人类的健康和社会的经济产生非常大的影响[1-2]。乙型流感病毒每年都会在全世界范围内流行，几乎占了流感疾病负担的1/3[3]，特别在儿童群体中能够引起严重的疾病后果[4-5]，1940年在1起儿童急性呼吸道传染病疫情中首次发现该病毒[6]。根据乙型流感病毒表面蛋白的抗原特性和血凝素基因的序列特征可将其分为Victoria和Yamagata两大谱系，代表株分别为B/Victoria/2/87和 B/Yamagata/16/88。另据流行病学监测资料显示自2000年起两个系别的病毒可在同一个流感流行季中共同循环[7-8]，在其交互流行或共同流行过程中，极有可能发生系间重配[9]。2001—2011年间(2009年除外)，美国流感监测数据显示乙型流感阳性样本数约占流感阳性样本总数的1% ～43.6%，平均为24%；而欧洲同期为1% ～59.8%，平均为 23%[10]。本文通过研究 2017—2018年度安徽省内流行的乙型流感病毒抗原性和基因特征，掌握该病原在安徽省的流行特征和分子进化特点，分析流行毒株与WHO推荐疫苗株成分是否匹配，为流感监测提供科学的防控依据。

1 材料与方法

1.1 流感监测数据 根据《全国流感监测技术指南》(2017年版)规定，一个流感监测年度的时间区间为每年的4月1日至次年的3月31日。从中国流感监测信息系统获取2015—2016、2016—2017和2017—2018监测年度安徽省流感监测网络实验室核酸检测结果，所有流感样病例样本来自国家流感哨点监测医院，并用EXCEL软件进行统计分析。

1.2 毒株来源 本研究的所有流感毒株均来自安徽省流感监测哨点医院采集的咽拭子标本，分离病毒后送至安徽省流感参比中心，经复核鉴定为乙型流感后进行后续实验，所有实验操作和运输保存均按照《国家流感监测方案(2017年版)》进行。

1.3 病毒抗原性分析 参考抗原采用WHO推荐的国际疫苗代表株，参考抗原和参考抗血清均由中国国家流感中心制备下发。根据《全国流感监测技术指南》(2017年版)的标准判定要求，当待检病毒与参考雪貂抗血清的HAI效价低于参考病毒与参考抗血清自身HAI效价的8倍(含8倍)或以上时，

则认为待检病毒是该参考抗血清检测到的低反应株；反之，当相差8倍以内时(不含8倍)，则认为待检病毒是参考病毒的类似株。

1.4 一步法RT-PCR扩增及产物纯化 OneStep RT-PCR试剂盒(CatNo:210212)Qiagen公司生产，反应液配置组分:5倍RT-PCR Buffer为10μl；上游和下游20μmol/L的引物各为1μl；10 mmol/L dNTPMix为2μl；OneStep RT-PCR Enzyme Mix为2 μl；然后用无RNA酶水24μl补齐到40μl的体系总量，最后再加病毒核酸模板10μl。反应条件为:第一阶段 42℃10 min、50℃30 min、95 ℃ 15 min，1个循环；第二阶段94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72℃90 s，35个循环，；第三阶段72℃10 min，1个循环。最后冷藏(4～8℃)保存。

1.5 全基因组序列测定 用琼脂糖凝胶切割回收扩增的产物，M13为测序引物，用BigDyeTMTerminator v3.1 Cycle Sequencing kit(AppliedBiosystemsTM，批号:4337455)进行测序反应。测序反应后的产物使用BigDyeXTerminatorTMPurification Kit((AppliedBiosys temsTM，批号:4376486)进行纯化，最后用基因测序仪(ABI 3730)开展测序分析(测序工作外包有资质的公司完成)。序列拼接和组装由DNAMAN(ver sion 6)软件完成。

1.6 序列分析 使用Mega6.0软件中的Clustal W法做序列比对分析，Neighbor-joining法做遗传进化分析，再分析HA和NA蛋白的关键氨基酸位点和变异位点。HA和NA进化分析参考株参照方斌等[11]研究方法，选用欧洲疾病预防控制中心2017—2018年流感季的概况报告(https://ecdc.europa.eu)，Yamagata系 1～3分支参考株各是:B/Wisconsin/1/2010 及 B/Brisbane/3/2007、B/Florida/4/2006；Victoria系1B与1 A分支参考株是B/Hong Kong/514/2009及 B/Brisbane/60/2008。

2 结果

2.1 2015—2018年安徽省乙型流感流行情况 由图1所示，安徽省乙型流感每年均有流行高峰，2015年7～8月份、2016年2月份、2016年11～12月份、2017年2月份、2017年8～9月份和2018年2月份均为甲型流感流行高峰月份；2015—2018年安徽省乙型流感Victoria和Yamagata两大谱系呈交替流行，2015年1～3月份以Yamagata系为主，2016年2～5月份以Victoria系为主，而2017年2～5月份流行Victoria系，9月份以后Yamagata系流行占据主导优势。由图2所示，2015—2016流感监测年度，WHO推荐B/Phuket/3073/2013(Yamagata系)为疫苗候选株，2015年12月份以后安徽省Yamagata系占全部乙型流感流行比例明显下降；2016—2017年度B/Brisbane/60/2008(Victoria系)为疫苗候选株，该监测年度安徽省仍以Victoria系乙型流感病毒为主要流行株；2017—2018年度疫苗候选株仍为Victoria系，安徽省Victoria系乙型流感自2017年7月份以后开始下降，同期Yamagata系占比呈明显上升态势。

图1 2015—2018年安徽省乙型流感病毒流行月分布Fig.1 Monthly distribution of influenza B virus in Anhui province from 2015 to 2018

图2 2015—2018年安徽省乙型流感病毒流行月占比Note:Vaccine strains agains influenza B virus recommended by the WHO for trivalent vaccines in the Northern HemisphereFig.2 Lineage-specific statistics for influenza B viruses in Anhui province from 2015 to2018

2.2 2017—2018流感监测年度安徽省乙型流感抗原性分析 从2017—2018流感监测年度内安徽省辖区内网络实验室送检至省级流感参比中心的乙型流感毒株中，随机选取了99株毒株进行抗原性分析，其中Yamagata系90株，Victoria系9株。WHO推荐该年度的三价疫苗组分中乙型Victoria系毒株为B/Brisbane/60/2 008类似株，四价疫苗组分包含了Yamagata系的 B/Phuket/3073/2013类似株[12]，国家流感中心以B/Brisbane/60/2008和B/Phuket/3073/2 013分别免疫雪貂制备了参考抗血清，对上述挑选的99株乙型流感毒株进行抗原性分析。Victoria系毒株抗原性分析结果显示:9株毒株全部为B/Brisbane/60/2008的类似株，无低反应株；Yamagata系毒株抗原性分析结果显示:90株毒株中有84株(93.3%)为 B/Phuket/3073/2013的类似株，6株(6.7%)为低反应株。

2.3 2017—2018安徽省乙型流感基因特征分析随机选取本年度乙型流感毒株31株进行HA和NA基因测序并构建进化树(图3)，进化分析显示:22株Yamagata系乙型流感病毒HA基因均属于Yamagata Clade 3分支，其中 20株与 B/Phuket/3073/2013疫苗株属于共同的亚支，而 B/Anhui-Yingzhou/11238/2017和B/Anhui-Yingzhou/11264/2017两株病毒HA基因属于另一亚支，还有一个亚支为B/Wisconsin/01/2010类似株；9株Victoria系乙型流感病毒HA基因均属于Victoria Clade1A分支，其中以 B/Hong Kong/286/2017和 B/Norway/2409/2017为代表的最新进化亚支 Clade1A(Δ1、Δ2)中未发现安徽省流行株。

根据上述31株乙型流感毒株NA基因进化分析发现，B/Anhui-Yingzhou/11238/2017和 B/Anhui-Yingzhou/11264/2 017两株Yamagata系病毒的NA基因属于Victoria系，与疫苗株B/Malaysia/2506/2004的NA基因亲缘关系较近，因此这两株Yamagata系病毒为BY-HA/BV-NA系间重配病毒。

所有22株Yamagata系乙型流感病毒HA基因和B/Phuket/3073/2013疫苗株相比，均有D196 N突变，除B/Anhui-Yingzhou/11238/2017和B/Anhui-Yingzhou/11264/2 017两株病毒以外，其他20株病毒HA基因均携带 L172Q和 M251V突变；9株Victoria系乙型流感病毒HA基因与B/Brisbane/60/2008疫苗株对比，均有I117V和N129D突变。根据NA基因序列对神经氨酸酶活性位点进行分析，安徽省流行的乙型流感病毒未发现对神经氨酸酶敏感性降低的分子突变。

3 讨论

乙型流感病毒两个谱系在某个区域的交叉循环流行几乎是不可预测的，从而导致WHO目前推荐的三价流感疫苗和当地流行的乙型流感谱系不匹配也常有发生[13]。2015—2016年度安徽省主要以Victoria系乙型流感病毒为主要流行株，而Yamagata系为疫苗候选株；2016—2017、2017—2018年度均以Victoria系为疫苗株，但2017年7月份以后，安徽省Yamagata系乙型流感呈明显的优势流行。因此近3年期间WHO推荐的三价疫苗株与安徽省流行的乙型流感病毒时常不匹配，但通过抗原性分析发现，2017—2018年度安徽省流行的乙型流感病毒均为WHO推荐疫苗株的类似株。由此可见，除了三价流感疫苗未完全覆盖安徽省所有流感型别外，疫苗接种率低也有可能是造成该年度Yamagata系乙型流感优势流行的重要原因之一。

尽管该年度安徽省流行的乙型流感病毒的HA基因均处于Yamagata系clade 3和Victoria系clade 1 A分支中，但均在分支出现了亚支，可能与宿主适应性选择相关，但安徽省Victoria系流感病毒未呈现“阶梯样”进化特征和Yamagata系复杂的拓扑结构[14]，可能是因为选取的样本时间跨度较短有关。值得关注的是，本研究首次发现安徽省存在BYHA/BV-NA系间重配病毒，且基因重配在乙型流感病毒的流行、进化过程中发挥着重要的作用[15]。方斌等[11]研究发现，乙型流感发生系内重配和系间重配的病毒均会造成该病毒的大流行，可能因为基因的重配将导致其发生抗原转变。由于人群广泛缺乏相应的免疫保护屏障，因而会引发乙型流感的暴发或流行[16]。安徽省发现的Yamagata系间重配病毒为2017年12月份分离，此时正值该系病毒流行峰值。尽管乙型流感病毒的点突变速率小于甲型流感病毒，但由于频繁地发生系内或系间重配，为病毒逃逸宿主既存的获得性免疫应答创造有利条件，使其可以长期在人群中流行[17]，因此应密切关注该病毒的分子变异。

将WHO推荐的2017—2018年度疫苗株 B/Brisbane/60/2008和 B/Phuket/3073/2013，与该年度安徽省乙型流感病毒分别比对它们的氨基酸序列，在重要的HA抗原表位190-helix(194～202)、160-loop(162～167)及150-loop(141～150)与120-loop(116～137)之中，有22株Yamagata系病毒的D196 N突变发生在190-helix抗原表位，该位点具有很强的抗原性[18]；9株Victoria系病毒的I117 V和N129D突变发生在120-loop抗原表位，该表位是突变最为频繁的区域，而129位点的突变可引起抗原变化[11，19]。

本文通过对安徽省2017—2018年度乙型流感病毒流行病学和基因特征进行分析，初步掌握了该病原在安徽省的基本情况，但仍需进一步分析该病原在人和动物间的流行近况，以及病毒进化特征和致病机理，从而制定合理的疫苗免疫接种策略进行科学防控。

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