羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中兰尼碱受体2表达变化的研究

李尧 黎建乐 肖康 马月 高丽萍 王晶 甄祯 郭燕军 石琦

100050北京,首都医科大学附属北京友谊医院神经内科(李尧、黎建乐、甄祯、郭燕军);102206北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所朊病毒室(肖康、马月、高丽萍、王晶、石琦)

朊病毒病是一种可侵袭人及动物神经系统的退行性疾病，致死率100%，目前尚无有效治疗措施。根据目前流行的朊病毒病发病机制学说，神经系统中正常存在的朊蛋白(prion cellular protein，PrPc)错误折叠后形成具蛋白酶抗性的异常朊蛋白(scrapie isoform of prion protein，PrPSc)，在神经系统沉积并导致神经元退行性变[1]。人类的朊病毒病包括人克雅氏病、库鲁病、致死性家族失眠症等。动物朊病毒病包括羊瘙痒病(scrapie)、牛的海绵状脑病(bovine pongiform encephalopathy，BSE)及麋鹿的慢性消耗性疾病(chronic wasting disease，CWD)等。朊病毒病典型的中枢神经系统病理改变包括淀粉样斑块沉积、神经元细胞丢失、胶质细胞增生和海绵样空泡变性。

钙离子是一种重要的细胞内第二信使。钙离子稳态对于维持细胞的正常形态和功能具有重要意义[2]。细胞胞浆内的钙离子主要来源于两个方面，分别为胞外钙离子内流和胞内内质网或肌浆网内的钙库。兰尼碱受体(ryanodine receptors，RyRs)作为一种广泛存在于细胞内质网和肌浆网的钙离子通道，他的开放可导致内质网或肌浆网中的钙离子进入胞浆内，参与维持细胞内钙离子稳态的平衡。

RyR2是兰尼碱受体家族的代表成员，不仅维持细胞内钙离子稳定，并在神经细胞发育和凋亡中起重大作用。研究发现，RyR2参与到阿尔兹海默病等变性疾病的发病过程，与异常蛋白如Aβ淀粉样蛋白的沉积关系密切。但对于RyR2与朊病毒病相互关系的研究甚少，RyR2在朊病毒感染人及哺乳动物中的表达变化尚未明确。本课题组在前期研究中应用2D-DIGE差异蛋白质组学研究方法发现，在遗传性朊病毒病脑组织中，RyR2表达明显上调，提示RyR2可能与朊病毒感染相关，为探索RyR2与朊病毒病之间的相互关系提供理论线索[3]。

本研究利用羊瘙痒因子仓鼠敏感株263 K感染的仓鼠为动物模型，通过免疫印迹方法探索RyR2在263 K感染仓鼠脑组织中表达水平的变化。通过免疫组织化学染色，明确了RyR2在朊病毒感染病变组织中的表达分布，并初步分析了RyR2与朊蛋白PrP的共定位关系，为进一步探讨和揭示RyR2在朊病毒病发病过程中的作用和分子机制提供实验依据和基础。

1 材料与方法

1.1 脑组织匀浆制备 羊瘙痒因子263 K感染的黄金仓鼠终末期(感染后第80 d)脑组织样品保存于-70℃冰箱，使用时分别用裂解液(10 mmol/L NaCI，10 mmol/L EDTA，0.5%NP 40，0.5%Sodium deoxycholate，10 mmol/L，Tris，pH7.4)制成10%(wt/vol)脑匀浆，2 000 g离心10 min去除组织碎片，取上清，置于-70℃备用。

1.2 Western blot检测 取15μg脑组织匀浆样本经SDS上样缓冲液处理后进行8%SDS-PAGE，电转至NC膜上，检测RyR2蛋白的电转移使用槽式湿转，将转移槽置于冰浴中，以200 V稳压电转3.5 h。检测β-actin使用半干式电转移，以160 mA稳流电转1.5 h。转膜成功后以5%脱脂奶封闭1 h，一抗孵育，4℃过夜后以PBS浸泡5 min×3次，以二抗室温孵育2 h，ECL显色。反应条带用软件Image J测定灰度值进行定量分析。所用抗体及稀释比例如下:RyR2兔源多克隆一抗(Abcam，1∶5 000稀释)、β-actin 鼠源单克隆一抗(Santa，1∶5 000 稀释)；二抗为HRP标记的抗鼠及抗兔IgG抗体(Santa，1∶5 000稀释)。

1.3 免疫组织化学染色 脑组织切片经常规脱蜡至水后，复合消化酶处理2 min，PBS浸泡2 min，微波抗原修复30 min，复温后PBS浸泡2 min，3%过氧化氢处理15 min，PBS浸泡3 min×3次，5%BSA室温封闭1 h，RyR2一抗孵育4℃过夜，PBS浸泡5 min×3次；加入二抗，37℃孵育0.5 h，PBS洗5 min，3次，DAB显色，苏木素复染、透明及封片，显微镜下拍摄照片。利用Image Pro Plus 6.0软件对免疫组织化学图片测定灰度值，进行定量分析。所用抗体及稀释比例如下:RyR2兔源一抗(Abcam，1∶200稀释)；二抗为生物素标记羊抗兔IgG试剂盒(中衫金桥)。

1.4 免疫荧光双标染色 脑组织切片处理同常规免疫组化方法，5%BSA室温封闭1 h后，加入RyR2特异性兔源多克隆抗体与PrP特异性鼠源单克隆抗体3F4的混合一抗，4℃孵育过夜后，PBS浸泡5 min×5次；加入 AlexaFlour 546标记的羊抗兔与AlexaFlour 488标记的羊抗鼠混合二抗，37℃孵育2 h，PBS浸泡5 min×5次，室温避光下DAPI染色20 min，PBS浸泡5 min×5次。抗荧光衰减封片剂封片，Operetta CLS高内涵细胞成像分析系统下观察。所用抗体及稀释比例如下:RyR2兔源一抗(Abcam，1∶200 稀释)、3F4 鼠源一抗(Santa，1∶250 稀释)；AlexaFlour 546标记的羊抗兔二抗(Invitrogen，1∶200稀释)、AlexaFlour 488标记的羊抗鼠二抗(Invitrogen，1∶200 稀释)。

1.5 统计学方法 实验数据应用SPSS13.0软件进行统计分析，两组间差异比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RyR2在朊病毒感染脑组织各脑区的表达为了探究RyR2在朊病毒感染脑组织中的分布和定位，本研究选取了正常仓鼠及羊瘙痒因子263 K感染仓鼠终末期(感染后第80 d)脑组织切片进行免疫组织化学染色。结果显示，RyR2在正常及263 K感染仓鼠脑组织中均有分布，两者分布区域大致相同，主要分布定位于小脑浦肯野细胞层及大脑皮层，在海马、下丘脑和嗅球也有分布。其中在正常仓鼠的各脑区中，与感染仓鼠相比，可以发现RyR2染色增强、阳性细胞数增多(图1)。利用Image Pro Plus 6.0软件对图片测定灰度值，进行荧光强度定量分析，结果显示，263 K感染仓鼠各脑区RyR2表达均明显降低，差异有统计学意义(图2)。

2.2 朊病毒感染仓鼠模型中RyR2表达降低 为了探究在朊病毒感染动物模型中RyR2表达的变化，本研究选取正常仓鼠及羊瘙痒因子263 K感染终末期仓鼠(感染后第80 d)为研究对象，利用Western blot检测 RyR2表达含量的变化。以 βactin为内参进行相对定量，使用Image J对目的蛋白条带进行灰度定量分析，结果利用t检验分析，结果显示，在263 K感染仓鼠脑组织中，RyR2的表达均较正常对照组明显下降，差异有统计学意义(P=0.037)(图3)。

2.3 RyR2与朊蛋白存在共定位关系 为了探究RyR2与朊蛋白(PrP)是否存在共定位关系，本研究选取了正常仓鼠及羊瘙痒因子263 K感染仓鼠终末期(感染后第80 d)脑组织切片进行免疫荧光双标染色。结果提示，在正常及263 K感染仓鼠脑组织切片的大脑皮层中，均发现了RyR2与PrP蛋白存在共定位关系(图4)。

图1 免疫组织化学检测朊病毒263 K毒株感染仓鼠及正常仓鼠脑组织中RyR2表达(×400)Fig.1 Immunohistochemical detection of RyR2 in scrapie-263 K infected and normal hamster brain tissue(×400)

3 讨论

RyR家族共有3种亚型:RyR1-3。在外周组织中，RyR1主要分布在骨骼肌；RYR2主要分布在心脏平滑肌；RyR3主要分布在一些上皮细胞、胃组织细胞及全身其他器官。而在中枢神经系统当中，3种亚型均有表达，其中 RyR2的表达最为丰富。RyR2主要分布于神经元细胞的内质网中，由同源四聚体组成，每个单体相对分子质量约为550×103。目前已有多种物质被证实与RyR2的活性有关，如FKBP、钙离子、钙调蛋白(CaM)、蛋白激酶 A(PKA)等[4]。

RyR2在神经元的树突、胞体、突触中均有分布[5]。在此前的文献报道中发现，哺乳动物中，RyR2主要分布在大脑皮层和小脑浦肯野细胞层，并在海马、丘脑等部位也有表达。除此之外，在嗅球、视神经、脑干等均发现RyR2的分布[6]。本研究利用免疫组织化学的方法探索RyR2在仓鼠脑组织中的分布，发现在正常和感染仓鼠的脑组织中，在大脑皮层、小脑、海马、嗅球、下丘脑均发现RyR2的表达，这与此前文献的报道基本符合。

图3 朊病毒263 K毒株感染仓鼠脑组织中RyR2表达含量与正常仓鼠比较Fig.3 RyR2 expression in the brain of scrapie-263 K infected was decreased compared with normal hamster

图4 免疫组织荧光检测显示，感染仓鼠终末期脑组织中RyR2与PrP存在共定位关系(×400)Fig.4 Co-localization between RyR2 and PrP in scrapie-263 K infected and normal hamster brain tissue(×400)

RyR2参与到记忆以及学习的形成过程，可以将不稳定的记忆整合成强大、持久的记忆痕迹。受过水迷宫训练的大鼠，可以发现其海马中RyR2表达增高[7]。给小鼠脑室内注射RyR2拮抗剂，可以发现小鼠的记忆能力较对照组下降[8]。其次，RyR家族还与药物成瘾、社交活动、情绪变化等症状表现关系密切[9-11]，这些都体现了RyR2在高级皮层功能方面的重要作用。因此，在正常生理状态情况下，大脑中RyR2的存在对于认知功能的形成有重要作用，RyR2的表达减少或者功能抑制会导致记忆力的损害。而快速进展的认知功能下降正是人类朊病毒病最常见的症状之一。本研究发现，RyR2的表达在朊病毒感染动物模型中明显下降，提示其可能与认知功能的快速下降有关。

除此之外，RyR2与神经变性疾病也有密切的联系。大部分研究都认为在阿尔兹海默病中，RyR2的表达较正常上升。Bruno等发现，在轻度认知障碍和阿尔兹海默病(Alzheimer disease，AD)患者的额叶脑组织中，都发现了RyR2的mRNA表达量的升高[12]，提示RyR2可能在认知功能障碍的早期即参与到疾病发展的过程中。Liang还发现，在AD模型小鼠中，接受RyR拮抗剂丹曲林处理的小鼠，其认知功能较对照组明显改善，海马区的老年斑形成也相对减少[14]。但也有少量研究得出了与之相悖的结果。Kelliher等[15]发现，在早期AD患者的脑组织中，RyR2的表达量明显减少。Andrea等则发现，在Aβ处理诱导的海马神经细胞株中，RyR2的表达减少[16]。在前期工作中发现RyR2在人遗传性朊病毒病脑组织中表达明显上调。而在263 K感染仓鼠动物模型中发现了相反的变化趋势，这说明RyR2在人和其他哺乳动物中可能发挥着不一样的功能；其次，这也说明仍需要更多的研究尝试，从不同的角度验证RyR2在朊病毒病中的表达变化。有趣的是，在心血管疾病中的研究领域中，不同学者对RyR2的研究也出现了这种互相矛盾的现象[16]。除此之外，在帕金森病、亨廷顿疾病、脊髓小脑共济失调等遗传相关的神经变性病中，也发现了RyR2表达或者钙离子代谢紊乱的问题[17-18]。

虽然RyR2在不同神经变性疾病中的表达变化有所争议，但普遍认为，RyR2介导了淀粉样蛋白对神经元细胞的损伤过程。学者们猜测，可能是包括Aβ、PrP在内的淀粉样蛋白通过刺激神经元细胞，造成内质网应激状态，导致内质网RyR2功能的紊乱，大量钙离子从内质网流入胞浆内，破坏神经细胞内钙离子稳态，进而导致神经细胞的凋亡[15]。因此，在朊病毒感染仓鼠模型中，RyR2的表达出现了明显的下降，其中的原因可能与PrPSc大量复制后影响RyR2的功能有关。除此之外，朊病毒病感染动物终末期的脑组织中，神经元的大量丢失也可能是导致RyR2表达含量下降的重要原因之一。

RyR2对于高级皮层功能的发育和完善有重要的作用，并介导参与了神经退行性病变的过程，RyR2的功能紊乱或者表达异常会影响神经细胞功能，甚至导致其凋亡。虽然目前已有学者探索RyR2作为靶点用于治疗阿尔兹海默病，但考虑到RyR2在两类疾病中这种截然相反的变化趋势，提示应用RyR2拮抗剂治疗朊病毒病的研究方向中，可能需要针对不同型别进行精准研究。这种差异对研究RyR2与朊病毒病的相互关系起到了重要的参考作用。

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