俄罗斯鲟β-防御素基因的克隆及表达分析*

白 莉 陈亚东 夏永涛 许式见 胡 谋 沙珍霞



俄罗斯鲟β-防御素基因的克隆及表达分析*

白 莉1,3陈亚东2,3夏永涛4许式见4胡 谋4沙珍霞2①

(1. 大连海洋大学水产与生命学院 大连 116023；2. 青岛大学生命科学学院 青岛 266071；3. 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071；4. 杭州千岛湖鲟龙科技股份有限公司 杭州 311701)

β-防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽，在脊椎动物免疫系统中发挥重要作用。本研究基于转录组Solexa测序结果，利用PCR和荧光定量PCR技术对俄罗斯鲟() β-防御素基因进行了克隆和表达模式分析。结果显示，俄罗斯鲟β-防御素cDNA片段长度为333 bp，包含开放阅读框(Open reading frame, ORF) 213 bp，推测编码71个氨基酸；SMART分析显示，该基因包含23个氨基酸的信号肽、1个防御素-β-2结构域和6个保守的半胱氨酸残基，此结构与其他物种极为相似，在进化中比较保守。同源比对发现，俄罗斯鲟β-防御素与鱼类的相似度最高，为54%~60%。β防御素基因在健康俄罗斯鲟11种组织(肝、肠、脾、头肾、胃、鳃、血液、脑、皮肤、肌肉和性腺)中均有表达，其中，在性腺和皮肤中表达量最高；病原菌嗜水气单胞菌()感染后可强烈影响β-防御素基因在6种免疫组织(肝、肠、脾、头肾、血液和鳃)中的时空表达。其中，在头肾中的上调表达最明显，在感染后72 h为表达峰值，达到0 h表达量的700倍。在脾、血液和肠中均有几倍至十几倍的上调，而在肝中整体呈现下调表达趋势。研究表明，β-防御素基因参与了俄罗斯鲟的免疫应答过程，本结果为俄罗斯鲟的免疫调控和病害防治研究奠定了基础。

俄罗斯鲟；β-防御素；基因克隆；基因表达；嗜水气单胞菌

防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽，广泛分布于植物、昆虫和脊椎动物中。根据对6个保守的半胱氨酸的位置和二硫键连接方式不同将防御素分为3个亚家族：α、β和θ-防御素(Zhu2013)。β-防御素是动物防御素系统中最大的成员，具有广谱的抗菌活性及不受传统抗生素耐药性菌株影响的抗菌机理，同时，与典型抗生素具有协同作用，能中和内毒素、调节机体免疫应答和炎症反应、调节组织创伤修复等而备受人们关注(张伟等, 2006)。

鲟鱼被称为“水中活化石”，近年来，俄罗斯鲟()养殖业在我国发展较快，由于其性成熟周期较长，养殖过程一旦发生病害，将对养殖业产生巨大影响，而嗜水气单胞菌()是致病的主要病原体之一(杨治国, 2001)。但俄罗斯鲟的免疫基因发掘及免疫机制鲜有报道。本研究在前期俄罗斯鲟性腺转录组(Chen, 2016)中挖掘到β-防御素部分序列的基础上，克隆了俄罗斯鲟β-防御素cDNA序列，推导出包含信号肽的完整蛋白序列，研究其组织表达及响应病原菌刺激后在免疫组织中的时空表达模式，为俄罗斯鲟免疫机理研究、病害防治和健康养殖提供有价值的研究资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康1.5龄俄罗斯鲟，体长为(47.5±2.5) cm，体重为(450±10) g。取自杭州千岛湖鲟龙集团有限公司，暂养于直径2 m、水深0.5 m的圆形玻璃钢养殖缸中，至少15 d后方可进行实验。养殖用水引自乌溪江，水温为17~20℃。嗜水气单胞菌为实验室保存菌种，分离自俄罗斯鲟病鱼组织，经16S rRNA测序进行菌种鉴定。

1.2 组织收集

分别收集3条健康俄罗斯鲟的肝、肠、脾、头肾、胃、鳃、血液、脑、皮肤、肌肉和性腺11种组织，立即放入液氮中，随后将组织转移至–80℃冰箱中保存，用于总RNA提取。采用腹腔注射方法按照半致死剂量(2.07×104CFU/g)进行病原感染。对照组注射同等体积的1×PBS溶液。收集感染0、6、12、24、48、72 h实验组和对照组，各取3条俄罗斯鲟的肝、脾、鳃、血液、头肾和肠组织，保存方式同上所述。

1.3 总RNA提取及cDNA的合成

采用液氮研磨收集的组织，参照总RNA提取试剂盒(天根, 北京)说明书进行组织总RNA提取。使用Agilent 2100生物分析仪(Applied Biosystems, 美国)检测其质量和浓度，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。按照Prime Script TM RT reagent kit (Perfect Real time) (宝生物, 大连)试剂盒合成cDNA，-20℃保存备用。

1.4 俄罗斯鲟β-防御素基因cDNA片段克隆

从俄罗斯鲟性腺转录组中筛选出β-防御素基因部分cDNA序列，采用Primer Premier 5.0在线软件(www.bio-soft.net)设计特异性引物P1和P2(表1)，以俄罗斯鲟11个组织混合cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增产物连接T载体，转化到T1感受态细胞中，对阳性克隆进行测序。

表1 俄罗斯鲟β-防御素基因克隆和表达分析所用引物

Tab.1 Primers used for cloning and expression of A. gueldenstaedti β-defensin

1.5 生物信息学分析

将测序拼接获得的基因序列运用NCBI(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/)Protein Blast进行β-防御素氨基酸同源性比对，使用在线软件SMART(http://smart. embl-heidelberg.de/)预测蛋白质结构域；信号肽预测采用SignalP3.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/ services/ SignalP/)，应用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/orffinder/)、DNAstar(http://www.dnastar.com/)、ClustalX1.83 (http://www.genome.jp/tools/clustalx/)和DNAMAN(http://www.lynnon.com/)等软件进行俄罗斯鲟β-防御素基因开放阅读框的查找及氨基酸多重序列比对分析。利用MEGA 5.1重复1000次构建N-J进化树。应用CPHmodels3.2server(http://www.cbs. dtu.dk/services/CPHmodels/)在线软件预测β-防御素蛋白的三维结构。

1.6 俄罗斯鲟β-防御素基因表达的实时定量分析

基因实时定量表达分析参照已报道的方法进行(路飏等, 2013; 于孟君等, 2017)。根据测序得到的俄罗斯鲟β-防御素cDNA序列设计qRT-PCR引物为P3、P4(表1)，以俄罗斯鲟18S rRNA基因为内参设计特异引物18S-F和18S-R(表1)。用SYBR Green荧光定量试剂盒(天根, 北京)按照说明书在ABI PRISM 7500Fast实时定量扩增仪上(ABI，美国)进行该基因的实时定量分析(qRT-PCR)。每个样品设置3个生物学重复，使用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量，值取3个平行样品的平均值。qRT-PCR检测结果使用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)的Duncan法对多组样本均数进行两两比较分析，0.05时，认为存在显著性差异。

2 结果

2.1 俄罗斯鲟β-防御素基因序列分析

克隆测序得到的俄罗斯鲟β-防御素基因部分cDNA片段长度为333 bp，用ORF finder软件分析其ORF长度为213 bp，编码71个氨基酸(图1)，与其他物种的同源序列所包含的ORF长度相当。信号肽和结构域分析结果显示，该基因序列包含23个氨基酸的信号肽、完整的β-防御素-2结构域(82~234)。

图1 俄罗斯鲟β-防御素cDNA序列和推测的氨基酸序列

推导的氨基酸序列显示在核苷酸序列下方，用大写字母表示；双下划线(=)所示为信号肽；方框所示为起始密码子(ATG)、星号(*)所示为终止密码子(TAG)；下划线(—)为defensin-β-2结构域

Translated amino acid sequence was shown under nucleotide sequence as uppercase; The iniation codon and termination codon were marked by a box and an asterisk, respectively; Signal peptide was shown with double solid line(=); Defensin-β-2 domain was shown with underline(—)

2.2 俄罗斯鲟β-防御素基因同源比对及系统进化分析

推导的俄罗斯鲟β-防御素氨基酸序列和其他物种的β-防御素氨基酸序列如斑马鱼(, NP_001075024.1)、青鳉(, ACG55699.1)、鳜(, AFA41485.1)、鲤(, AGZ03658.1)、梭鱼(, AIK66783.1)、点带石斑鱼(, AFA41485.1)、福鼎蝾螈(AHF22421.1)、原鸡(, ALI16124.1)、小鼠(EDL32923.1)、大鼠(, AAC61871.1)、恒河猴(, AAC61871.1)和人(, AAH93985.1)等进行同源比对。结果显示，俄罗斯鲟β-防御素与其他物种的氨基酸序列同源性在39%~60%之间，其中，与斑马鱼和鲤鱼的同源性最高，为60%，其次是鳜鱼59%，与青鳉的同源性最低，为54%。但在不同的物种之间，都具有6个保守的半胱氨酸残基(图2)。

利用MEGA 5.1以N-J法构建基于上述物种β-防御素氨基酸序列的分子系统进化树。结果显示，系统进化树分为两个大的分支，俄罗斯鲟β-防御素与斑马鱼、青鳉、鳜、梭鱼、点带石斑鱼聚为一大支，其中俄罗斯鲟单独聚为一个亚支，与斑马鱼和鲤进化关系最近；小鼠、大鼠和人聚为另外一个大支，其中，鼠类按亲缘关系远近聚成相应的亚支；两栖类福鼎蝾螈单独聚为一个分支(图3)。

2.3 β-防御素蛋白质空间结构预测

预测的俄罗斯鲟β-防御素的3D结构如图4所示。结果显示，C38和C66、C44和C60及C48和C67之间分别形成3对二硫键，6个保守的半胱氨酸残基按照箭头方向形成反向平行的β片层折叠结构，对β-防御素结构稳定具有重要作用。该结构与斑马鱼β-防御素-2非常相似，从结构上判断，获得的俄罗斯鲟β-防御素基因应属于β-防御素-2基因。

2.4 β-防御素基因在俄罗斯鲟健康组织中的表达分析

图2 推导的俄罗斯鲟β-防御素氨基酸与其他物种已知同源序列比对

图中标黑处表示6个保守的半胱氨酸残基及位置，分别是C38、C44、C48、C60、C66和C67

Six conserved Cysteine residues (C38, C44, C48, C60, C66 and C67) in β-defensin protein were highlighted by black color

图3 俄罗斯鲟与其他物种的β-防御素系统进化分析

图4 预测的俄罗斯鲟β-防御素蛋白质三维结构

三个二硫键：C38和C66(绿色)，C44和C60(蓝色)和C48和C67(红色)，箭头方向表示β-片层折叠

Three disulfied bonds were formed C38-C66 (green), C44-C60 (blue) and C48-C67 (red), respectively Arrow mark indicates β-sheet

qRT-PCR结果显示，β-防御素基因在检测的健康俄罗斯鲟11种组织(肝、肠、脾、头肾、胃、鳃、血液、脑、皮肤、肌肉和性腺)中均有不同程度的表达(图5)。以表达量最低的血液(1.0)为对照，相对表达量最高的组织是性腺(21.75)，其次是皮肤(10.05)、胃(2.5)、肌肉(2.4)，在肝(1.5)和脾(1.5)、鳃(1.05)、肠(1.2)、脑(1.25)及头肾(1.1)中的表达量相对较低，β-防御素基因在不同组织中表达存在特异性。

2.5 俄罗斯鲟感染嗜水气单胞菌后β-防御素基因在免疫组织中的表达分析

图5 β-防御素基因在健康俄罗斯鲟组织中的表达

L: 肝; In: 小肠; Sp: 脾; HK:头肾; Sk: 皮肤; Mu: 肌肉; Gi: 鳃; Br: 脑; Bl: 血液; Go: 性腺; St: 胃。字母“a，b，c”代表SPSS多重分析的不同分组，有相同字母表示差异不显著(0.05)，无相同字母表示差异显著(<0.05)。下同L: Liver; In: Intestine; Sp: Spleen; HK: Head-Kidney; Sk: Skin; Mu: Muscle; Gi: Gill; Br: Brain; Bl: Blood; Go: Gonad; St: Stomach. The letters ‘a, b, c, d’ are subsets by Duncan algorithm. The same letters indicate unsignificant difference (0.05), the different letters indicate significant difference (0.05). The same as below

图6 俄罗斯鲟感染嗜水气单胞菌后β-防御素基因在免疫组织中的表达

每个时间点的β-防御素的表达量为感染组除以PBS组的相对表达量

The expression level of β-defensin at each timepoint was presented as relative expression in which the infected group divided by the PBS group

嗜水气单胞菌感染俄罗斯鲟0、6、12、24、48和72 h后，β-防御素基因在6种免疫组织(肝、肠、脾、头肾、鳃和血液)中呈现不同的表达特征，结果如图6所示。嗜水气单胞菌感染俄罗斯鲟后，β-防御素在头肾、血液、肠、脾和鳃5种组织中均呈现上调表达，只是各组织中峰值出现的时间点不同，在肝中则呈现下调趋势。其中，β-防御素基因在头肾中呈现最为显著的上调表达，与0 h相比，在感染后6 h后即出现了10倍的增加，在感染后的12~48 h，基因表达表现为几十倍到上百倍不等的上调，到感染72 h达到峰值，为0 h表达量的700倍；β-防御素基因在小肠、血液和脾中整体上表现为上调表达，最大表达峰值达到几倍到十几倍，在鳃中表达量变化不大，最高的表达量出现在感染后12 h，为0 h表达量的2倍，其他时间点表达量与0 h相当；β-防御素基因在肝脏中则总体呈现下调表达模式，感染12~72 h后，表达量与0 h相比，呈现近5倍的明显下调表达。

3 讨论

养殖环境的生态环保对鱼类健康养殖产业提出了严格要求，发展替代抗生素的绿色无污染的渔药如抗菌肽等势在必行。鱼类β-防御素已被证明具有明显的抗菌、抗病毒功能(Jin, 2010; Casadei, 2009)，具有广阔的应用前景。但目前鱼类β-防御素的研究不深入，亟待在更多的鱼种和功能分析上进行更深入的研究。俄罗斯鲟是生产鱼子酱的主要鱼种之一，经济价值很高，开展免疫机理和绿色病害防治研究，对发展和稳定鲟鱼养殖产业具有重要意义。本研究关于俄罗斯鲟β-防御素基因的克隆和表达研究，是俄罗斯鲟宿主免疫的首次报道。

俄罗斯鲟β-防御素基因cDNA长度为333 bp，ORF为213 bp，编码71个氨基酸，包含23个氨基酸的信号肽和48个成熟肽，目前报道的不同鱼类的β-防御素前体分子一般由62~77个氨基酸残基组成，信号序列和前导序列含有22~38个氨基酸残基，成熟肽序列由39~45个氨基酸残基组成(Casadei, 2009)，本研究结果与报道结果吻合。另外，俄罗斯鲟β-防御素C端包含6个保守的半光氨酸残基，形成3个二硫键结构，与报道的鱼类β-防御素结构一致(Dong, 2015; Ruangsri, 2013; Guo, 2012; Ellis, 2001)。俄罗斯鲟β-防御素蛋白质空间结构预测形成3个β-片层折叠，与斑马鱼BD-2的结构(Ellis, 2001)很类似，SMART结构域预测，俄罗斯鲟β-防御素包含β-防御素-2结构域，同源序列比对的结果也证实其与斑马鱼BD-2的相似度最高，为60%，这些证据都指明所获得俄罗斯鲟β-防御素基因应属于β-防御素-2，在进化上还是属于相对原始的类型。

本研究初步研究了俄罗斯鲟的克隆、组织表达及相应病原刺激的免疫应答，后续研究尚需进一步深入。由于俄罗斯鲟的基因资源还远远不足，缺乏基因组及多数组织的转录组数据，加之俄罗斯鲟的基因组又极其复杂，染色体数目多达236条(尹洪滨等, 2006)，β-防御素有可能存在较多的同源基因和重复基因，在一定程度上对俄罗斯鲟β-防御素基因的克隆和精准分型造成困难。由于获得的俄罗斯鲟cDNA片段长度只有333 bp，缺乏合适的位点设计RACE引物，我们尝试多次克隆，仍无法获得完整的5¢和3¢全长，但我们获得了完整的ORF，对进一步开展功能研究奠定了良好基础。在后续研究中，将进一步验证其对不同病原(细菌、病毒)等的体内和体外抗菌活性的研究，为俄罗斯鲟的绿色病害防治途径探讨可行之路。

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Cloning and Expression Analysis of β-Defensin Gene from Russian Sturgeon ()

BAI Li1,3, CHEN Yadong2,3, XIA Yongtao4, XU Shijian4, HU Mou4, SHA Zhenxia2①

(1. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116023; 2. College of Life Sciences, Qingdao University, Qingdao 266071; 3. Key Laboratory for Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 4. Hangzhou Qiandaohu Xunlong Sci-Tech Co. Ltd. Hangzhou 311701)

β-defensins are cysteine, cationic, antibacterial peptides that play very important roles in the vertebrate immune system. In this study, the cDNA fragment of β-defensin gene fromwas cloned using a PCR method based on the Solexa sequencing results of gonad transcriptome, and gene expression was performed by qRT-PCR. The results showed that cDNA of β-defensin was 333 bp in length and contained an open reading frame (ORF) with 213 bp, which was deduced to encode a precursor peptide of 71 amino acids consisting of a signal peptide of 23 amino acid residues and a mature peptide of 48 amino acid residues. Russian sturgeon β-defensin possessed six conserved cysteine residues, forming three disulfide bridges at C38~C66, C44~C60 and C48~C67, and containing 1 defensin-β-2 domain. This structure is very similar to other species and conserved in evolution. Homologous alignment revealed that Russian sturgeon β-defensin had the highest sequence identity with fish species, about 54%~60%. qRT-PCR analysis showed the β-defensin transcript is constitutively expressed in 11 tissues (liver, intestine, spleen, head-kidney, gill, blood, brain, skin, muscle and gonad, stomach) in healthy fish, with highest expression in the gonads and skin. Artificial infection ofwithresulted in a significantly upregulated expression in the intestine, spleen, head kidney, blood, and gill while downregulating expression in the liver. The most significant upregulated expression and the peak level at 72 h reached 700 times baseline in the head-kidney. The results indicateβ-defensin genes are involved in the immune response.

; β-Defensin; Gene cloning; Gene expression;

* 中国水产科学研究院基本科研业务费(2014A03XK01)资助项目[This work was supported by Special Scientific Research Funds for Central Non-Profit Institutes, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences (2014A03XK01)]. 白 莉，E-mail: Baili_soul@163.com

沙珍霞，研究员，E-mail: shazhenxia@163.com

SHA Zhenxia, E-mail: shazhenxia@163.com

2018-01-12,

2018-02-01

10.19663/j.issn2095-9869.20180112001

白莉, 陈亚东, 夏永涛, 许式见, 胡谋, 沙珍霞. 俄罗斯鲟β-防御素基因的克隆及表达分析. 渔业科学进展, 2018, 39(5): 20–26Bai L, Chen YD, Xia YT, Xu SJ, Hu M, Sha ZX. Cloning and expression analysis of β-defensin gene from Russian sturgeon (). Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(5): 20–26

S917.4

A

2095-9869(2018)05-0020-07

(编辑 冯小花)