一步法荧光RT-PCR检测肠道病毒EV71的研究

刘晓青

手足口病(Hand-foot-mouth Disease，HFMD)是一种由肠道病毒感染引起的急性传染病，以婴幼儿发病为主，主要症状是发烧和手足口三个主要部位出现丘疹样的皮疹[1]。每年大概在4～8月是一个流行的高峰，多发于5岁以下儿童，尤其是3岁以下的儿童发生率最高。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，包括肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)、柯萨奇病毒A组(Coxsackievirus A)4、5、9、10、16型等，其中肠道病毒毒EV7l型最为常见，占最高比例。肠道病毒EV71是人肠道病毒的一种，简称为EV71，常引起儿童手足口病、病毒性咽峡炎，重症患儿可出现为肺水肿、脑炎等，统称为肠道病毒EV71感染疾病[2-3]。近年手足口感染肠道病毒EV71率呈上升趋势，连续数年成为我国传染病发病率最高的病种之一，重症及死亡病例多由EV-A71所致，对我国儿童的健康造成严重危害，因此研发出一种高灵敏度、准确度、特异性的检测方法，对手足口病防治与治疗显得尤为重要。

伴随着分子技术的发展，采用荧光定量RT-PCR技术对肠道病毒进行诊断国内外已有报导，该方法具有快速、灵敏、准确以及自动化程度高的特点，适用于传染性病毒的检测[4-6]。肠道病毒71型是2008年以后发现的一种新型病毒，该病毒现在感染引起的手足口病越来越多，比科萨奇A组16型的毒力要强得多，引起了大量的不太严重的普通病例，但是其中它引起的一些重症的病例病情非常严重，并且导致了部分病例的死亡。由于EV71肠道病毒基因组的高度变异率，针对EV71病毒及其它肠道病毒基因组设计的引物及探针都具有一定的时效性，需要不断更新。本实验对EV71病毒检测方法的研究，为快速准确诊断EV71肠道病毒奠定基础[7]，及时准确检测患者，有利于减少手足口病的重症及死亡病例,保护我国儿童生命健康[8]。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究对象 EV71肠道病毒样品，汕尾逸挥基金医院2017年10月份收集的样品；大肠杆菌DH5a实验室保存；RNA提取试剂盒，Taq酶购买于上海生物工程有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物和探针设计 在NCBI核酸序列数据库中，搜索选择国内近3年流行EV71型肠道病毒基因序列，采用DNAstar软件进行clustalV方法比对，选择EV71型肠道病毒型序列共同的保守区，利用Primer 5.0软件设计引物和探针，得到引物和探针序列如表1。

表1 引物和探针系列及荧光标记

1.2.2 阳性重组质粒的制备 ①荧光RT-PCR扩增条件：42℃ 30 min,95℃ 2 min,1个循环；95℃ 25 s，60℃ 20 s，40个循环；72℃ 5 min。RT-PCR反应结束后，取10 μL PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。②目的基因的纯化及回收:PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切取目的片段，用DNA纯化回收试剂盒回收目的cDNA，回收后置-20℃冰箱保存备用。③目的基因的克隆及鉴定:将回收的DNA片段连接到pMDl8-T载体上，再转入到感受态细胞DH5a中进行培养，挑取单克隆菌落到液体培养基中扩大培养，然后用高纯质粒小量制备试剂盒提取质粒，进行荧光定量PCR鉴定及琼脂糖凝胶电泳鉴定，最后将阳性重组质粒送到上海英维捷基贸易有限公司测序鉴定。

1.2.3 实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 ①实时荧光定量RT-PCR检测方法的优化:以阳性重组质粒为模板，选用不同的引物浓度、退火温度、反应时间进行RT-PCR反应，不断地优化其反应条件，得到最佳的RT-PCR反应条件。②线性范围评估及最低检测拷贝数确定：以9×107,9×106,9×105,9×104,9×103,9×102,9×10 copies/μL的阳性重组质粒作为模板，进行荧光定量PCR扩增，确定荧光定量PCR检测线范围及最低检测限的拷贝数。③重复性试验：选取9×102copies/μL浓度梯度的阳性重组质粒，每个稀释浓度进行10个重复检测。根据每个稀释浓度的Ct值计算变异系数，判定该检测方法的重复性是否良好。④临床样品检测试验:利用建立的EV71型荧光定量PCR检测方法，对经确诊为EV71型病毒感染的15份RNA样本和5份阴性RNA样本进行检测，评价其临床实用性。

1.3 统计学分析

采用SPASS 17.0统计学软件处理重复性Ct值变异系数，Ct值变异数cv≤5%，具有统计学意义。

2 结果

2.1 目的基因的克隆和重组质粒的鉴定

PCR产物经回收后，与pMDl8 克隆载体连接构成建重组质粒，用“1.2”中的引物和探针对重组质粒进行PCR扩增，得到一条大小约130 bp的DNA片段(DNA Marker DL2 000)，与连接前的PCR产物大小一致(图1)。将经PCR鉴定的阳性重组菌株送到上海英维捷基贸易有限公司进行测序鉴定，测序结果与目的片段序列完全一致。

注：1，2，3表示EV71 PCR 扩增的DNA片段

2.2 实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

荧光定量PCR检测线范围及最低检测限拷贝数的确定 以梯度倍释的阳性质粒为模板进行RT-PCR扩增，在9×102～9×107copies/μL检测范围内线性拟合度良好，相关系数R2值为0.98，斜率为-4.26，扩增效率为94.56%，固确定荧光定量PCR检测线范围为9×102～9×107copies/μL，最低模板拷贝数为900 copies/μL。见表2。

表2 荧光定量RT-PCR反应条件的优化

2.3 检测限重复性

试验选取9×102copies/μL的标准模板以优化的反应条件分别连续扩增10次，经方差分析，组内与组间CV≤5%，重复性很好，最低检测限为900 copies/μL (图2)。用该建立的荧光定量PCR检测方法对80份阳性样本和36份阴性样本进行检测，荧光定量PCR检测结果与实际诊断结果一致，检测准确率达100%。

图2 EVUN基因片段实时荧光定量RT-PCR方法的检测限试验

3 讨论

手足口病主要致病血清型包括柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CV)A组4～7、9、10、16型和B组1～3、5型，埃可病毒(Echovirus)的部分血清型和肠道病毒71型(Enterovirus A71，EV-A71)等，其中以CV-A16和EV-A71最为常见。EV71病毒可引起疱疹性咽峡炎，严重患者可引起神经性系统损伤，比如说包括脑干，特别是延髓的部位受损，还可能引起脊髓的损伤，病情继续发展的话甚至会引起神经源性的肺水肿；重症及死亡病例多由EV-A71所致。近年部分地区CV-A6、CV-A10有增多趋势。肠道病毒各型之间无交叉免疫力。手足口病是全球性疾病，我国各地全年均有发生，发病率为37.01/10万～205.06/10万，近年报告病死率在6.46/10万～51.00/10万之间。

肠道病毒之间具有一定的同源性，不利于各血清型的区别鉴定，因此本试验选取肠道病毒基因中的一段高度保守高特异的序列作为目的基因检测片段，从而避免了漏检及非特异检测问题[9]。荧光定量RT-PCR检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料法，荧光探针法除了特异引物外，还增加了特异性的荧光探针，从而提高了特异性和准确度，更适合临床和科研的需要[10-12]。

手足口病病原检测试方法的研究，有利于手足口病患者及时诊断，做到早发现、早诊断、早治疗，是防治手足口病的关键[13-15]。一步法荧光PCR检测，缩短了检测时间，节约生产成本，与常规的检测方法相比，具有很大的优势，可适用于手足口临床快速诊断，为检测手足口病病原的研究奠定基础。