cTfh细胞及相关miR—146a在乙肝疫苗记忆性免疫应答中的动态表达及关联研究

余祖卫　李玉莲　陈丽华　尹明娟　黄玲凤　张艳

[摘要]目的 检测乙肝疫苗记忆性免疫应答过程中miR-146a与外周血滤泡辅助性T细胞（cTfh）动态表达水平，分析miR-146a、Tfh与乙肝疫苗免疫应答之间的相关性。方法 于2017年7月招募大朗社区卫生服务中心已完成3针乙肝疫苗标准程序的健康成人接种1针乙肝疫苗，收集12例健康志愿者的外周血标本。在疫苗接种后的不同时间点，采用ELISA法测定血清中乙肝表面抗体（HBsAb）浓度；采用流式细胞术检测外周血单个核细胞（PBMC）中Tfh细胞、B细胞、浆细胞、记忆性B细胞的比例；采用荧光定量PCR检测miR-146a的相对表达量。结果 cTfh在疫苗接种后第7天达到最高（P=0.001），HBsAb水平在疫苗接种后第14天达到最高，差异有统计学意义（P<0.001）。Tfh细胞与B细胞成负相关（r=-0.426，P=0.03），浆细胞与HBsAb成正相关（r=0.330，P=0.04）。miR-146a与cTfh、HBsAb均无相关性（P>0.05）。结论 Tfh细胞可能参与乙肝疫苗记忆性免疫应答过程，但未能证明miR-146a与乙肝疫苗免疫应答存在相关性。

[关键词]miR-146a；滤泡辅助性T细胞；乙肝疫苗；免疫应答；相关性

[中图分类号] R512.62 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）7（b）-0012-04

[Abstract] Objective To detect the dynamic expression levels of miR-146a and circulating T follicular helper （cTfh） cell during immune response of hepatitis B vaccination， and then analyze the association between miR-146a， cTfh cell and the immune response of hepatitis B vaccination. Methods In July 2017， a group of healthy adults who had completed the standard procedure for the hepatitis B vaccination in Community Health Service Center of Dalang Country were recruited to receive one dose of hepatitis B vaccination， and peripheral blood samples were collected from 12 volunteers at different time points after vaccination， ELISA method was used to measure the concentration of Hepatitis B surface antibody （HBsAb） in serum； Flow cytometry was used to detect the proportion of Tfh cells， B cells， plasma cells， and memory B cells in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs）. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the relative expression of miR-146a. Results cTfh cell reached the highest level （P=0.001） on the 7th day after vaccination， and the HBsAb reached the highest level on the 14th day after vaccination， and the difference was statistically significant （P<0.001）. There was a negative correlation between the Tfh cells and B cells （r=-0.426， P=0.03）， and a positive correlation between the plasma cells and HBsAb （r=0.330， P=0.04）. There was no significant correlation between the expression level of miR-146a， cTfh cell and HBsAb （P>0.05）. Conclusion Tfh cells might play a role in the immune response to hepatitis B vaccination， but not demonstrate the association between miR-146a and the immune response of hepatitis B vaccination.

[Key words] miR-146a； T follicular helper cell； Hepatitis B vaccination； Immune response； Association

乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染是全球性公共衛生问题，每年约有100万人死于乙肝感染，迄今并无特效治疗方法。世界卫生组织（WHO）指出接种乙肝疫苗是控制HBV感染最经济、有效的措施。研究表明按标准程序接种后仍有5%～10%的健康人群不能产生保护性的抗体水平，处于无/弱应答状态（<10 IU/ml为无应答者，10～100 IU/ml为弱应答者），该人群仍对HBV易感[1]。

乙肝疫苗弱应答的发生机制尚不清楚，乙肝疫苗免疫应答的机制研究可以为乙肝疫苗弱应答机制研究提供思路。滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cells，Tfh细胞）是近年来发现主要辅助B细胞的T细胞亚群，对B细胞增殖与分化、高亲和力抗体的产生、抗体的类别转换、免疫记忆的发生是不可或缺的[2]。相关文献报道外周血中ICOS+CXCR3+CXCR5+CD4+T细胞与流感疫苗免疫应答相关[3]，Crotty[4]报道了增加Tfh细胞可以增强狂犬疫苗的保护效果，而Tfh细胞是否参与乙肝疫苗免疫应答尚不清楚。

miRNA介导的转录后调节在Tfh细胞分化、发育过程中都发挥着关键性作用[5]。在这些与免疫调节相关的miRNAs中，多个研究证明miR-146a是调控Tfh细胞分化和功能的关键性miRNA[6-7]。在Tfh细胞中miR-146a表达水平明显高于其他效应T细胞，miR-146a可以直接靶向作用Tfh细胞上的ICOS，对Tfh细胞分化起制约作用，防止过度免疫反应发生[8]。

本研究旨在探讨Tfh细胞及其miR-146a与乙肝疫苗免疫应答是否存在关联，为进一步阐明乙肝疫苗弱应答发生机制提供理论参考。

1资料与方法

1.1一般资料

于2017年7月招募东莞市大朗社区卫生服务中心健康志愿者12例，男、女各6例，年龄23～36岁，体重42～68 kg。纳入标准：①愿意全程参与实验，并服从实验安排；②无基础疾病，未感染过HBV；③最近1年内未接种过乙肝疫苗。排除标准：①对疫苗存在过敏反应；②实验期间发生其他感染性疾病。告知研究对象研究内容与目标，签署知情同意书。本研究经广东医科大学附属医院医学伦理委员会批准。

1.2试剂与仪器

重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）供应商为葛兰素史克生物制剂公司；ELISA试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司；鼠抗人CD19-PE、鼠抗人CD-27-FITC、鼠抗人CD38-BV421均购自BD公司；鼠抗人CD4-PerCP、鼠抗人CXCR5-PE均购自eBioscience公司；淋巴细胞分离液、EasySepTM human CD4+ T-cell enrichment kit均购自STEMCELL公司；TRIzol试剂购自Invitrogene公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit、FastStartUniversal SYBR Green Master试剂均购自Roche公司。仪器主要有多功能酶标仪（购自BioTekInstruments 公司）、流式细胞仪（BD公司）、基因扩增仪（Eppendorf公司）、PikoREAL荧光定量PCR（Thermo公司）。

1.3方法

1.3.1乙肝疫苗接种 所有实验对象在大朗社区卫生服务中心预防接种门诊接种乙肝疫苗，接种部位与方式为上臂外侧三头肌，肌内注射。接种乙肝疫苗后，预约安排采血时间，于接种疫苗前和接种后第7、14、28天采集受试者晨起空腹静脉血。采血部位为肘前静脉，采血量为20 ml左右。

1.3.2 ELISA法检测血清中HBsAb浓度 将采血管室温静置30 min，待有血清析出，每管收集200 μl血清-80℃保存、备用。ELISA法检测血清中HBsAb浓度（具体操作步骤参照说明书），多功能酶标仪测量吸光度。

1.3.3流式细胞术检测外周血Tfh细胞、B细胞、浆细胞、记忆性B细胞的比例变化 利用淋巴细胞分离液通过梯度离心法分离外周静脉血单核细胞（PBMC）。取两管1×106外周血单核细胞，用1 ml Buffer液重悬细胞300 g，室温离心10 min，弃上清，再用100 μl重悬细胞，一管加流式抗体CD4-PerCP、CXCR5-PE，另一管加入流式抗体CD19-PE、CD27-FITC、CD38-BV421，用移液器轻轻吹打混匀，避光室温孵育30 min，孵育结束后加入1 ml Buffer，重悬细胞300 g，室温离心10 min，弃上清，用400 μl 2%多聚甲醛固定细胞，所得样品使用流式细胞仪检测，结果以“%”表示。

1.3.4 qRT-PCR检测miR-146a相对表达量 在PBMC细胞基础上用免疫磁珠法富集人外周血中CD4+细胞。用500 ulTRIzol裂解CD4+细胞，提取总RNA，使用miR-146a茎环法反转录引物、逆转录试剂盒反转录成cDNA，以U6为内参进行定量PCR，反应程序为95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 34 s，40个循环。引物序列详见表1，以U6为内参测定miR-146a的mRNA表达情况。

1.4统计学方法

使用SPSS 15.0和GraphPad Prism 5统计学软件进行数据分析和相关性分析，不同时点均数比较采用重复测量资料的方差分析，相关性采用双变量相关性分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 HBsAb浓度动态变化

用ELISA方法检测血清中的HBsAb浓度，结果显示接种疫苗后HBsAb浓度显著增高，于第14天达到最高，差异有统计学意义（F=50.3，P<0.001）（表2）。

2.2外周血中Tfh细胞、B细胞亚群的动态变化

通过荧光抗体进行标记，用流式细胞术检测外周血中Tfh细胞（CXCR5+CD4+T细胞）、B细胞（CD19+）、浆細胞（CD19+CD27+CD38+）、记忆性B细胞（CD19+CD27+CD38-）比例。流式分析圈门策略见图1。结果显示接种乙肝疫苗后Tfh细胞增高，于第7天达到最高，差异有统计学意义（F=8.46，P=0.001）；接种乙肝疫苗后B细胞、记忆性B细胞均减少，差异无统计学意义（F=0.24，P=0.869；F=1.37，P=0.285）；接种乙肝疫苗后浆细胞增高，于第28天达到最高，差异有统计学意义（F=5.24，P=0.009）（表2）。

2.3 CD4+细胞中miR-146a表达水平

通过qRT-PCR检测CD4+细胞中miR-146a mRNA表达水平，结果显示接种乙肝疫苗后miR-146a处于动态变化，均于第14天表达量达到最高，差异有统计学意义（F=9.88，P=0.003）（表2）。

2.4相关性分析

分别对miR-146a与Tfh细胞进行相关性分析，结果显示，miR-146a与Tfh细胞无相关性（r=-0.068，P=0.71）（图2-A）；将miR-146a与HBsAb进行相关性分析，结果显示，miR-146a与HBsAb无相关性（r=-0.085，P=0.64）（图2-B）；将Tfh细胞与B细胞、浆细胞与HBsAb进行相关性分析，结果显示，Tfh细胞与B细胞成负相关（r=-0.426，P=0.03），浆细胞与HBsAb成正相关（r=0.330，P=0.04）（图2-C、图2-D）。

3讨论

目前，乙肝疫苗弱应答的发生机制尚未明确，但由于乙肝疫苗激发机体免疫反应是T细胞依赖的，所以国内外绝大多数学者认为，T细胞的辅助作用是乙肝疫苗弱应答发生的关键。自乙肝疫苗推广使用以来，辅助性T细胞（T helper cell，Th）一直是乙肝疫苗弱应答发生机制研究的热点[9-10]，近年来发现Tfh细胞才是主要辅助B细胞的T细胞亚群，而miRNA广泛参与T细胞激活及免疫应答调节。目前，Tfh细胞及相关miR-146a是否与乙肝疫苗免疫应答存在关联未见报道。因此，明确Tfh细胞及相关miRNA在乙肝疫苗免疫应答中的作用，對进一步阐明其在乙肝疫苗弱应答发生机制有重要参考价值，并为新型乙肝疫苗佐剂研制、HBV感染的防控提供科学依据。

由于人体接种乙肝疫苗后外周血中CXCR5+CD4+T细胞（cTfh）也具有Tfh细胞相同的表型特征，在转录调控机制上与Tfh细胞有共同之处，且同样具有辅助B细胞功能[11]。在人的淋巴组织样本难以获得情况下，采用cTfh细胞作为替代物是目前普遍且可行的研究方法。研究结果显示，接种乙肝疫苗之后cTfh细胞构成比于第7天达到最高，提示其参与乙肝疫苗免疫应答的过程。体液免疫过程中，浆细胞可以合成、分泌抗体，结果显示接种疫苗之后浆细胞的比例增高，HBsAb表达水平增高，提示接种乙肝疫苗之后Tfh细胞数量增多，增强乙肝疫苗免疫应答。此外，相关性分析显示cTfh细胞与B细胞成负相关趋势，而浆细胞与抗体成正相关趋势，提示在乙肝疫苗免疫应答过程中cTfh细胞增高可以辅助B细胞分化为浆细胞产生抗体，促进免疫应答。而相关性分析显示，miR-146与cTfh细胞、HBsAb均无相关性，提示miR-146可能并不参与乙肝疫苗的免疫应答过程。

综上所述，Tfh细胞可能在乙肝疫苗免疫调节中起重要作用，而miR-146并不能通过调控Tfh细胞参与乙肝疫苗免疫应答的过程。Tfh细胞是否参与乙肝疫苗弱应答发生过程以及作用机制还需进一步研究。

[参考文献]

[1]崔富强，庄辉.我国乙型肝炎防控工作进展、挑战及对策[J].中国病毒病杂志，2016，6（2）：81-87.

[2]许晶瑶，谢韬，姚文清.发展中国家乙型肝炎流行、预防和控制[J].中国公共卫生，2016，32（1）：31-34.

[3]Zuckerman JN.Protective efficacy，immunotherapeutic poten-tial，and safety of hepatitis B vaccines[J].J Med Virol，2006， 78（2）：169-177.

[4]Crotty S.Follicular helper CD4 T cells（TFH）[J].Annu Rev Immunol，2011，29（1）：621-663.

[5]Ise W，Fujii K，Shiroguchi K，et al.T Follicular helper cell-germinal center B cell interaction strength regulates entry into plasma cell or recycling germinal center cell fate[J].Immunity，2018，48（4）：702-715.

[6]Eivazi S，Bagheri S，Hashemzadeh MS，et al.Development of T follicular helper cells and their role in disease and immune system[J].Biomed Pharmacother，2016，84：1668-1678.

[7]Vinuesa CG，Linterman MA，Yu D，et al.Follicular helper T cells[J].Annu Rev Immunol，2016，34（1）：335-368.

[8]Lefebvre JS，Lorenzo EC，Masters AR，et al.Vaccine efficacy and T helper cell differentiation change with aging[J].Oncotarget，2016，7（23）：33581-33594.

[9]Pilkinton MA，Nicholas KJ，Warren CM，et al.Greater activation of peripheral T follicular helper cells following high dose influenza vaccine in older adults forecasts seroconversion[J].Vaccine，2017，35（2）：329-336.

[10]Linterman MA，Hill DL.Can follicular helper T cells be targeted to improve vaccine efficacy？[J].F1000Res，2016，5：12688.

[11]Bentebibel SE，Lopez S，Obermoser G，et al.Induction of ICOS+CXCR3+CXCR5+ TH cells correlates with antibody responses to influenza vaccination[J].Sci Transl Med，2013， 5（176）：176ra132.

[12]Wang Z，Li M，Zhou M，et al.A Novel rabies vaccine expressing CXCL13 enhances humoral immunity by recruiting both T follicular helper and germinal center B cells[J].J Virol，2017， 91（3）：JVI.01956-16..

[13]Farooq F，Beck K，Paolino KM，et al.Circulating follicular T helper cells and cytokine profile in humans following vaccination with the rVSV-ZEBOV Ebola vaccine[J].Sci Rep，2016，6：27944.

[14]Jiang SH，Shen N，Vinuesa CG.Posttranscriptional T cell gene regulation to limit Tfh cells and autoimmunity[J].Curr Opin Immunol，2015，37：21-27.

[15]Ichimiya S，Kamekura R，Kawata K，et al.Functional RNAs control T follicular helper cells[J].J Hum Genet，2017，62（1）：81-86.

[16]Maul J，Baumjohann D.Emerging roles for microRNAs in T follicular helper cell differentiation[J].Trends Immunol，2016，37（5）：297-309.

[17]Qiu H，Wu H，Chan V，et al.Transcriptional and epigenetic regulation of follicular T-helper cells and their role in autoimmunity[J].Autoimmunity，2017，50（2）：71-81.

[18]Pratama A，Srivastava M，Williams NJ，et al.MicroRNA-146a regulates ICOS-ICOSL signalling to limit accumulation of T follicular helper cells and germinal centres[J].Nat Com-mun，2015，6（3）：6436.

[19]羅志明，熊咏珍，林伟研，等.T细胞活化信号分子基因miRNA结合区域SNP与乙肝疫苗弱应答的关联研究[J].现代免疫学，2015，35（3）：188-192.

[20]范惠珍尹，夏红梅.接种乙肝疫苗对成人外周血Th1/Th2的影响研究[J].中国现代医学杂志，2012，22（34）：81-83.

[21]Saffar H，Saffar MJ，Ajami A，et al.Long-term T-cell-mediated immunologic memory to hepatitis B vaccine in young adults following neonatal vaccination[J].Hepat Mon，2014，14（9）：e22223.

[22]Schmitt N，Bentebibel SE，Ueno H.Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood[J].Trends Immunol，2014，35（9）：436-442.

（收稿日期：2018-04-12 本文编辑：闫 佩）