上皮细胞黏附分子和滋养层细胞表面抗原 2在大鼠梗阻性肝损伤动物模型中的研究

温力牧，夏医君

作者单位： 315040宁波，宁波市医疗中心李惠利东部医院（温力牧）；内蒙古自治区人民医院（夏医君）

梗阻性肝损伤（OHI）是指胆道系统因各种原因发生完全或不完全梗阻后，导致肝板破坏，肝血窦闭塞或窦周纤维化，假小体形成等一系列肝脏形态学和生物学改变[1]。以往研究表明短期的胆道梗阻引发的肝脏结构改变是可恢复的，如果梗阻超过一定时间，会造成肝脏结构的不可逆损伤，最终可发展为继发性肝硬化[2]。随着外科水平以及相关诊断技术水平的进步，对于早期的梗阻的发现和治疗已经日趋标准化。但目前对于OHI的进程发展，临床缺少梗阻及再通后肝功能治疗恢复指南。

EpCAM通常认为是细胞表面黏附分子，其不仅作用于细胞之间的相互黏附[3]，并且通过释放胞外域，同时实现胞内域的核转位，同结构域蛋白、联蛋白和淋巴增强子结合因子1形成复合核和触发相关传导信号，从而调节膜内蛋白水解[4]，是肝损伤后肝内侧枝循环生成、肝纤维化中汇管区无功能的胆管细胞增生和以及相关胆管细胞肿瘤的发生中的关键环节。TACSTD基因家族的另一成员TROP2，与相关的转录因子形成调控网络，以调节细胞的生长信号[5]。本文研究上皮细胞黏附分子（EpCAM）及滋养层细胞表面抗原2（TROP2）与大鼠梗阻性肝组织损伤进程的关系。现报道如下。

温力牧，夏医君.上皮细胞黏附分子和滋养层细胞表面抗原2 在大鼠梗阻性肝损伤动物模型中的研究

图1 B组各时点HE染色结果（HE，×200）

图2 C组各时点HE染色结果（HE，×200）

图3 EPCAM免疫组化结果（苏木素，×400）

1 资料与方法

1.1 实验动物 成熟雄性Wistar大鼠48只，年龄11周，体质量250～300g，由内蒙古大学实验动物中心提供。无特定病原体级（SPF级），饲养于恒温、清洁的环境中，以标准饲料喂养，并维持12h昼夜节律。

1.2 试剂 兔抗鼠EpCAM一抗、兔抗鼠TROP2一抗以及免疫组化试剂盒均购自北京奥博森生物技术有限公司，DAB显色试剂盒（20X）购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 实验分组 成熟雄性Wistar48只大鼠，采用数字表方法随机分成3组。对照组（A组）：行手术对照组，行开关术。结扎组（B组）：行硅胶管置入胆管结扎术。再通组（C组）：行硅胶管置入胆管结扎术后7天行再通。A、B组分别于术后第1、3、5、7d处死（每次处死4只，分组为A1～7，B1～7），C组于再通后第1、3、5、7d处死（每次处死4只，分组为C1～7）[6-7]。

1.4 动物模型制作 A组：术前12h禁食，6h禁水，称量体质量，10%的水合氯醛3ml/kg腹腔麻醉。取正中切口，游离并显露肝十二指肠韧带后关腹，行假手术对照。B组：术前准备麻醉及切口同A组，剥离肝十二指肠韧带，确认大鼠胆总管。于胆总管上行近肝门处取大小约0.5mm切口，置入硅胶管结扎固定，同理于胆总管下行胰腺上段置入硅胶管另一端，经皮下于颈背部引出。观察背部引流的硅胶管是否有少量淡红色或浅黄色液体流通，丝线结扎外管后关腹，做成胆管梗阻模型。C组：以B组相同方法建立胆管梗阻模型，梗阻7 d后剪断背部结扎线，观察是否有黄褐色液体流通，建立胆管再通模型。

1.5 观察指标 （1）检测血清酶学变化，主要包括总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT），腹主动脉取血样送检，由Cobas-8000c701全自动生化分析仪检测完成；（2）肝脏石蜡制片HE染色光镜下观察肝组织样本；（3）免疫组化采用SP法，按试剂盒说明进行EpCAM和TROP2的免疫组织化学染色。两者均为细胞膜以及部分细胞质中出现黄褐色特异染色为阳性表达，每张切片均随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，计算细胞阳性表达率。表达率小于5%定义为阴性表达，表达率5～15%定义为弱阳性表达，表达率15～40%定义为中等阳性表达，表达率大于40%为强阳性表达[8]。

1.6 统计方法 采用SPSS17.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，采用独立样本t检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清酶学变化 急性胆道梗阻后，B组血清ALT、AST于术后第1～3 d迅速上升至高峰，而3～7d逐渐趋缓，并有逐渐下降趋势；C组ALT、AST于解除梗阻后1～3 d持续保持高值，3 d后方出现降低。实验检测同时发现大鼠的血清TBIL以及DBIL于结扎后第5d方达到峰值，而5～7d趋于稳定，这同AST、ALT的变化进程并不完全一致，见表1。

2.2 HE染色结果 对照组各个样本肝板结构清楚，中央静脉无明显扩张，汇管区内无增生小胆管及增生纤维细胞等异型结构出现。B组术后1 d汇管区稍显增宽，肝小叶间纤维组织少量增生，炎细胞浸润；术后3 d见局部小胆管增生，细胞间质嗜中性粒细胞等炎细胞浸润较前明显增多，小叶间纤维组织增生明显，其中以汇管区胆管扩张、增生、异型为重；术后7d部分肝板形态改变，中央静脉增宽，肝细胞可见灶状、点片状坏死，沿汇管区可见局部出现条索样纤维增生，且有向周围蔓延增生趋势。随结扎时间延长，大鼠肝脏损伤纤维化进程明显加重。见封三彩图1。

C组再通后1d大鼠肝细胞可见明显坏死，肝小叶局部淡染灶，小叶间汇管区异型明显，有细小胆管增生及纤维细胞条索样结构出现；3 d肝板片状坏死灶较前无显著改变，原扩张异型明显的中央静脉形态逐渐恢复，汇管区结构较前清晰，其中增生胆管较多；5 d肝小叶形态结构逐渐恢复，其内可见点状散在坏死灶；7d肝板内肝细胞坏死灶较前范围缩小，且汇管区内纤维细胞形成的条索束装结构可见减少。见封三彩图2。

2.3 免疫组化结果

2.3.1 EpCAM免疫组化结果 A组为弱阳性表达；B组中随结扎时间延长，其阳性细胞比率逐渐上升至结扎第5d峰值后持续保持平稳高值；C组中其阳性细胞比率逐步下降。3组阳性细胞比率在相同时间点差异均有统计学意义。见表2、见封三彩图3。

2.3.2 TROP2免疫组化结果 A组中为阴性表达；B组中随结扎时间延长，其阳性细胞比率逐渐升高；C组中阳性细胞比率随再通时间延长始终保持高值。B组与C组阳性细胞比率在1、7 d差异均有统计学意义。见表3、封三彩图4。

3 讨论

3.1 大鼠梗阻性肝损伤的组织学改变 本实验中大鼠肝脏梗阻后3d Metavir肝纤维化评分标准即达Ⅱ级，对比梗阻7 d肝组织可发现，肝组织增生异型多发生在汇管区，而肝板内肝细胞的坏死灶增多并不明显。由此可推想急性梗阻性肝损伤在7 d内的主要部位集中在汇管区，是由局部纤维细胞形成积聚，无功能的小胆管增生，导致汇管区正常毛细胆管组织受压迫，进一步诱导肝细胞变性坏死。

解除梗阻后，对比再通术后1 d和7 d切片，可见肝板片状坏死灶减少并不明显，原扩张明显的中央静脉形态逐渐恢复，汇管区结构较前清晰，提示7 d内再通术后肝组织汇管区结构恢复时序要早于肝细胞恢复，同时可推测知梗阻解除后肝小叶间的旁路代偿作用逐渐减退，正常的胆管毛细引流通道可能是肝细胞恢复因素之一。

3.2 EpCAM 在梗阻性肝损伤中的表达与意义Laurent等[9]对肝前体细胞研究发现，应激状态下EpCAM通过组织授予的相关信号片段，调节膜内蛋白水解生成，从而在肝前体细胞和增生胆管上皮细胞中出现强阳性表达。本实验中，EpCAM不仅在细胞膜表面存在表达，而且局部胞质中也出现阳性染色，这可能与其在梗阻性肝损伤时，胞内结构域EpICD的核转位作用密切相关[10]。结合Mladen等[11]研究可推测在急性胆道梗阻状态下 EpCAM 阳性细胞比率增加可与肝损伤进程相关，由于再通后其阳性细胞数逐步下降，可认为其为急性梗阻期肝脏损伤程度进程指标；但对比同期组织切片，解除梗阻后术后3d肝细胞片状坏死灶较前无显著改变，汇管区增生胆管较多，而再通后5 d肝小叶形态结构逐渐恢复，胆管增生较前减少，可推测其对再通后后修复进程评估较差。

3.3 TROP2在梗阻性肝损伤中的表达与意义Okabe等[12]对出现梗阻性肝损伤的鼠肝脏中研究显示，上皮细胞黏附分子相关蛋白TROP2在肝卵圆细胞中表达，其能诱导肝卵圆细胞代替造血干细（HSCs），分化成为肝细胞和胆管细胞。本实验中TROP2阳性染色细胞大多分布在汇管区增生胆管细胞以及水肿的肝细胞胞质和细胞膜上，这与其他研究的表达部位并不完全一致，由于其信号传导通路至今尚不清楚，且其与EpCAM高度相关，推测其在梗阻性肝损伤的急性期有除了传导膜外信号可能有部分蛋白结构是经由胞质及胞核发挥作用。结合本实验结果，预计梗阻性肝损伤后，TROP2在增生胆管细胞及部分肝前体细胞胞膜中持续呈阳性表达至肝组织形态恢复一定阶段，由于随解除再通时间延长，其阳性表达比率将稳定保持一定水平，借此可提示肝损伤后修复进程发展，但由于其梗阻与再通前后差异性不显著，其难以判断肝损伤中损伤进程发展。

表1 各组实验血清学变化

表2 不同组别EPCAM阳性率表达%

表3 不同组别TROP2阳性率表达 %