自噬标志物LC3B表达水平的改变与星形细胞瘤手术患者预后的相关性研究

王航 宋歌 刘永建 谢万福

星形细胞瘤是人类最常见的脑肿瘤。世界卫生组织(WHO)[1]根据肿瘤的程度将星形细胞瘤分为4级，其中Ⅲ级和Ⅳ级肿瘤是高度恶性的，分别以间变性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤(GBM)为例，它是人类最常见和最恶性的原发性脑肿瘤。为了早预防早治疗，进行了大量与星形细胞瘤的严重程度相关的生物标志物如环氧合酶-2[2]，胰岛素样生长因子结合蛋白[3]、肌醇[4]的表达水平影响星形细胞瘤进展的研究。然而相关的机制研究较少。

癌症干细胞(cancer stem cell,CSC)是指具有干细胞特征的癌细胞，能够自我更新，并且产生异质性的肿瘤[5]。胶质母细胞瘤中CSC细胞的放射性抗性和化疗耐药性已被确定[6-7]，这是患者临床疗效差的一个原因。CSCs对抗化疗可能是因为CD133+细胞下调自噬相关蛋白[8]。

自噬构成了分解代谢机制，通过溶酶体降解不必要或功能失调的细胞组分[9]。最近的研究表明，自噬不仅在调控癌症发展中发挥重要作用，而且在癌细胞对抗癌治疗的反应方面也可能发挥作用[10-11]。随后的研究还鉴定了微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)[12-13]和Beclin-1[14-15]作为自噬的基本标记。其中LC3B是化疗后晚期乳腺癌的预后指标[16]。

本研究评估星形细胞瘤患者中LC3B和Beclin-1的蛋白表达水平。同时，由于癌样干细胞已被发现是新型抗癌疗法的有吸引力的靶标[17-18]，本研究也分析了CD133在星形细胞瘤患者中的表达水平。

1 对象与方法

1.1 研究对象

根据手术记录、医疗记录、病理报告和MRI图像，回顾性收集本院神经外科于2009年12月-2012年12月诊断的星形细胞瘤患者的218张薄切片。排除了免疫组织化学染色较差的样本、病例记录不完整或没有随访资料的患者。最后本研究共选取106个样本进行研究。本研究经本院评估委员会批准。

1.2 免疫组织化学染色

为了检索免疫组织化学染色的抗原，福尔马林固定，石蜡包埋的组织块的3 μm切片脱石蜡，再水合，并在121 ℃的温度下在pH9.0的目标回收溶液(Dako，Glostrup，丹麦)中高压灭菌10 min；通过在室温下在3%过氧化氢中孵育5 min来阻断切片中的内源性过氧化物酶；然后将切片在Tris缓冲液(Dako，K9001)中洗涤并与1∶200稀释的兔多克隆抗人CD133(Biorbyt，orb18124，UK)，Beclin-1(abcam，ab16998，USA)和LC3B (SANTACRUZE，sc-16755，欧洲)抗体在室温下1 h；用Tris-缓冲溶液洗涤后将切片与缀合有辣根过氧化物酶的第二抗体在室温下孵育30 min；随后将载玻片在3,3-二氨基联苯胺中孵育5 min，然后将梅耶苏木精复染60 s，并用Entellan(产品编号HX247305，Merck)固定；在双盲的情况下评估免疫组织化学染色的切片；Beclin-1和LC3B的染色评分如下：阴性：0分(没有或<10%的肿瘤阳性细胞)；弱阳性：1分(肿瘤阳性细胞10%～30%)；阳性：2分(30%～70%的肿瘤阳性细胞)；强阳性：3分(70%～100%)。CD133染色评分为阴性：0分(如果65%的细胞被抗体染色)；弱阳性：1分(5%～20%，包括20%的染色细胞)；阳性：2分(20%～50%，包括50%的染色细胞)；强阳性：3分(>50%的染色细胞)[19]。对于统计分析，0分和1分定义为低表达组，2分和3分定义为高表达组[20]。同时从病例中获取患者的年龄、性别、肿瘤分级、接受放疗或化疗的基本资料。

1.3 统计学处理

采用SPSS19.0 (SPSS，Chicago，IL，USA)；采用卡方检验分析Beclin-1和LC3B蛋白表达水平与临床资料的关系；采用Kaplan-Meier法进行log-rank检验分析生存率。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 LC3B和Beclin-1蛋白表达水平与临床参数的关系

图1和图2分别显示了Beclin-1和LC3B的表达水平强弱，即低、中、高强度的免疫化学染色。星形细胞瘤患者的年龄、性别、肿瘤分级以及化疗耐受性均未与Beclin-1蛋白表达水平有关系(表1)。LC3B蛋白表达水平与辐射或化疗有关系(P=0.02)。没有其他临床参数与LC3B蛋白表达水平有关系(表1)。Beclin-1蛋白表达水平与患者其他的临床参数无明显关系，同时与患者辐射、化疗也无明显关系(表1)。

图1 星形细胞瘤切片中Beclin-1蛋白表达水平的代表性免疫组织化学染色 A为0分,极低强度组;B为得分1,低强度组;C为得分2,中强度组;D为3分,高强度组(×100倍)

2.2 LC3B和Beclin-1蛋白表达水平与生存率的关系

Beclin-1蛋白表达水平与患者的总体生存率不相关(图3)。相反，LC3B的免疫化学染色的高强度预测不良预后(图4)。同样，LC3B蛋白表达阴性或弱阳性表现出与高LC3B水平相似的生存曲线。LC3B表达的低水平和中等水平的生存率要比LC3B表达的高水平的生存率高(图4)。

图2 星形细胞瘤切片中LC3B蛋白表达水平的代表性免疫组织化学染色 A为0分,极低强度组;B为得分1,低强度组;C为得分2,中强度组;D为3分,高强度组(×100倍)

表1 Beclin-1和LC3B蛋白表达水平与临床参数的关系

注：LC3B为微管相关蛋白1轻链3B型

图3 使用Kaplan-Meier方法和log-rank检验评估Beclin-1蛋白表达水平与星形细胞瘤患者总生存率的关系(P>0.05)

图4 使用Kaplan-Meier方法和log-rank检验评估LC3B蛋白表达水平与星形细胞瘤患者总生存率的关系 高强度的LC3B免疫组织化学染色预测不良预后;LC3B蛋白表达阴性也存在相似的生存曲线

2.3 CD133和LC3B表达水平在星形细胞瘤中的预后价值

图5显示了具有弱、低、中、高强度的CD133的代表性免疫化学染色切片。CD133和LC3B高表达的患者的总生存期为38个月，而CD133和LC3B两者均为弱表达的患者的总生存期为170个月(图6)。CD133和LC3B的高水平表达是星形细胞瘤预后不良的指标(P<0.05)。

图5 在星形细胞瘤切片中代表性的免疫组织化学染色CD133(癌症干细胞样细胞标记物) A为0分,极低强度组;B为得分1,低强度组;C为得分2,中强度组;D为3分,高强度组(×100倍)

3 讨 论

Ⅳ级星形细胞瘤是最常见的一类恶性原发性脑肿瘤，也是最具侵袭性的癌症之一。先前的研究表明，癌症干细胞样细胞对放疗或化疗耐药[6]，并且这些细胞的富集是预后不良的指征[21-23]。由于LC3B蛋白的表达水平与放疗和化疗的耐药性相关(表1)，本研究评估了CD133与LC3B在总体生存中的表达。诊断后的中位生存期通常只有14个月[24]。GBM管理的标准治疗包括手术切除、局灶放疗、以及替莫唑胺等烷化剂治疗[25]。然而这些治疗方法并不能有效地提高GBM患者的存活率。因此，目前研究主要集中在探究预测患者预后的通路和分子标记方面上。

图6 使用Kaplan-Meiermethod和log-rank检验评估CD133和LC3B蛋白表达水平的组合与星形细胞瘤患者的生存率的关系 CD133和LC3B高表达患者的平均总生存期为38个月,CD133和LC3B两者均为弱表达的患者的平均总生存期为50个月

本研究发现自噬标志物LC3B的表达水平增高与星形细胞瘤患者的放疗/化疗有关，并且影响患者的生存率。此外，增加LC3B的表达以及增强的CD133水平也与不良预后显著相关。有研究报道，自噬抑制剂可使肝癌干细胞(LCSCs)、乳腺癌细胞对肿瘤微环境更敏感，并可用于改善抗癌治疗[24]。同样，雷帕霉素在神经胶质瘤起始细胞中诱导自噬也增加了对辐射的敏感性[26]。

自噬构成了基本的分解代谢机制，其涉及通过溶酶体降解不必要或功能失调的细胞组分[9]。自噬是一把双刃剑，一方面自噬可以上调自噬水平导致耐药性的癌细胞的凋亡；另一方面恶性肿瘤细胞的转移和扩散也离不开自噬的作用，肿瘤细胞在抵抗化疗药物杀伤过程中自噬也起到重要保护作用。通过激活自噬，选择性识别和清除未折叠蛋白质和受损细胞器，从而避免凋亡作用发生[27]。

本研究发现，高水平的自噬标记物LC3B导致与放射和/或化学疗法的抗性显著相关。在我们的研究中增强的自噬是疾病进展的结果，而不是由其他研究者报道的化学诱导[26]。此外，本研究使用的细胞类型与其他研究中使用的细胞类型明显不同，因为GBM对化疗和放疗高度耐药。需要进一步的探究自噬标记物对星形胶质细胞的作用。本研究Beclin-1没有表现出类LC3B的特性，对于Beclin-1的分析还需进一步研究。

有研究指出，由于自噬能力下调，GBM中LC3B-II和Beclin-1的表达水平降低[19]。与本研究结果一致，本研究还发现LC3B的高水平表达与不良预后相关。本研究结果表明，虽然没有统计学意义，自噬减少会导致更晚期的星形细胞瘤。自噬在肿瘤发生中的作用是复杂的[27]。它一方面可以抑制肿瘤发生早期的肿瘤发展；另一方面自噬还可以促进已建立肿瘤的肿瘤进一步发展。本研究结果表明，高水平的LC3B表达或增强自噬与预后不良和自噬作为肿瘤启动子的作用相一致。

最近，GBM癌症干细胞已经被证明参与了肿瘤内皮的形成，增加了肿瘤的侵袭力，并且通过各种机制导致对放疗的抵抗。本研究结果表明CD133(癌症干细胞样细胞标志物)和LC3B的高水平表达是星形细胞瘤预后不良的指征。这些结果表明，星形细胞瘤癌症干细胞样细胞和增强的自噬可引起对放射疗法/化学疗法的抗性，并且针对星形细胞瘤中的癌症干细胞样细胞可提供可行的治疗方法。