杜洪亮 何等旗 于涛 车银富 陶峰 李阳
肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是一种生理状态下由间质细胞产生的具有多功能的细胞生长因子,其与受体c-Met结合后,发挥多种生物学作用,包括促进多种肿瘤细胞的增殖、分化、转移、刺激新生血管及淋巴管生成等[1-3]。有研究发现,HGF促进肿瘤转移是通过其受体c-Met起作用的[4]。另有研究表明,HGF在肿瘤中的表达与VEGF-C的表达相关[5]。但HGF调控肿瘤细胞增殖、分化的具体机制尚不清楚。
口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,以局部侵袭和淋巴转移为特点[6]。口腔鳞癌患者存在HGF及受体c-Met的高表达[7],但HGF对口腔鳞癌患者的效应及其机制尚不清楚。有研究发现,口腔鳞癌患者HGF的增高与VEGF-C的表达有关[8]。本研究通过口腔鳞癌裸鼠移植瘤模型,观察不同剂量HGF对口腔鳞癌裸鼠肿瘤生长的效应,并探讨其作用机制,为口腔鳞癌的治疗提供新的思路。
1.1.1 实验动物 BALB/c-nu/nu裸鼠36 只,5 周龄,雌雄兼用,体重18~30 g(上海实验动物中心提供)。瘤株:人舌鳞癌细胞株Tca8113由四川大学华西口腔疾病研究国家重点实验室提供。
1.1.2 主要试剂与仪器 HGF(Peprotech,美国);兔抗多克隆抗体HGF、c-Met(Santa Cruz Biotechnology,美国);VEGF-C(Zymed,美国);DMEM高糖培养基、MEM培养基、胎牛血清(Hyclone,美国);高速冷冻离心机(Sigma,Sigma 3-18K,德国);CO2恒温细胞培育箱(Heraeus,德国);超净工作台(Nuaire,美国);OLYMPUS IX71倒置相差显微镜(Olympus,美国),微量移液枪(Eppendorf公司,德国)。
1.2.1 动物模型的建立 32 只裸鼠皮下接种Tca8113细胞悬液0.1 ml,浓度为5×106/0.1 ml。接种后2 周,肿瘤直径达0.2~0.5 cm,将荷瘤裸鼠随机分为5 组,阴性对照组8 只,其余各组6 只。
1.2.2 实验分组 将口腔鳞癌裸鼠移植瘤模型裸鼠32 只,随机分为5 组:①阴性对照组:8 只,不做任何处理;②B组:6 只,瘤内注射PBS 50 μl;③HGF 20 ng组:5 只,瘤内注射HGF 20 ng/d;④HGF 40 ng组:5 只,瘤内注射HGF40 ng/d;⑤HGF 100 ng组:5 只,瘤内注射HGF 100 ng/d。注射1 次/d,连续给药5 d后,第6天测肿瘤体积,取瘤块,称瘤重。
1.2.3 移植瘤生长情况评价 肿瘤体积:测量肿瘤最长径(a)及与之垂直的最短径(b),按公式V=0.5×a×b2计算肿瘤体积[9]。观察肿瘤体积变化。
肿瘤重量:连续给药5 d后,第6天脱臼处死小鼠,小心剥离瘤体,称重。
1.2.4 荷瘤小鼠移植瘤HGF、c-Met及VEGF-C的表达测定 采用免疫组织化学法,用兔抗人多克隆抗体HGF(1∶100稀释)免疫染色检测HGF的表达,兔抗人多克隆抗体c-Met(1∶100稀释)免疫染色检测c-Met的表达,兔抗人多克隆抗体VEGF-C(1∶100稀释)免疫染色检测VEGF-C的表达, 染色依照试剂盒说明书进行。
HGF的表达定位于细胞膜及细胞质呈棕黄色颗粒为阳性。c-Met的表达主要位于细胞膜和细胞质,VEGF-C的表达以细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表达,胞浆透明或无色为阴性。每张病理切片计数10 个高倍镜下阳性细胞的数目。免疫组化染色的评估由2 名病理科医师采用盲法分别独立进行。首先进行定性分析抗体染色表达模式的差别,然后进行定量分析。两名病理医师判断的差别通过讨论解决。
36 只裸鼠有32 只成瘤,成瘤率为88.89%。皮下接种Tca8113细胞悬液2 周后,裸鼠皮下明显可见瘤体生长,约0.2~0.5 cm大小。实验全程无裸鼠死亡。
荷瘤裸鼠荷瘤情况及肿瘤破溃见图 1。分组后各组荷瘤裸鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。肿瘤体积在注射HGF前和注射HGF后以及肿瘤质量各组之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。肿瘤破溃情况各组之间差异无统计学意义(P>0.05)(表 1)。
图 1 荷瘤裸鼠荷瘤情况及肿瘤破溃情况
表 1 裸鼠肿瘤体积、瘤重及肿瘤破溃情况
肿瘤HGF、c-Met及VEGF-C的表达结果见表 2。
荷瘤裸鼠肿瘤HGF的表达在HGF 40 ng组和HGF 100 ng组明显增高。HGF 40 ng组与阴性对照组相比,差异具有统计学意义(P=0.046),与PBS组相比差异具有统计学意义(P=0.049);HGF 100 ng组与阴性对照组及PBS组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05);但HGF 40 ng组与HGF 100 ng组之间的差别不明显(P=0.723)。病理切片同样显示,HGF蛋白的表达在HGF 40 ng组和HGF 100 ng组最多,其次为HGF 20 ng组,表达最少的为阴性对照组和PBS组。各组HGF的表达病理染色切片见图 2。
表 2 肿瘤HGF、c-Met及VEGF-C的阳性细胞数Tab 2 Positive cell count of the expression of HGF、c-Met and VEGF-C in the tumor of the groups
注: ①HGF 40 ng组与阴性对照组比较,P=0.046; ②HGF 40 ng组与PBS组比较,P=0.049; ③HGF 100 ng组与阴性对照组比较,P=0.020; ④HGF 100 ng组与PBS组比较,P=0.021; ⑤HGF 40 ng组与阴性对照组比较,P=0.023; ⑥HGF 40 ng组与PBS组比较,P=0.023; ⑦HGF 100 ng组与阴性对照组比较,P=0.002; ⑧HGF 100 ng组与PBS组比较,P=0.002; ⑨HGF 40 ng组与阴性对照组比较,P=0.01; ⑩HGF 40 ng组与PBS组比较,P=0.011
荷瘤裸鼠肿瘤c-Met的表达在HGF 40 ng组和HGF 100 ng组明显增高。HGF 40 ng组与阴性对照组及PBS组相比,差异均具有统计学意义(P=0.023);HGF 100 ng组与阴性对照组及PBS组相比,差异均均具有统计学意义(P=0.002)。病理切片同样显示,c-Met的表达在HGF 40 ng组和HGF 100 ng组最多,其次为HGF 20 ng组,表达最少的为阴性对照组和PBS组。各组c-Met的表达病理染色切片见图 2。
荷瘤裸鼠肿瘤VEGF-C的表达在HGF 40 ng组最多。HGF 40 ng组与阴性对照组及PBS组相比,差异均具有统计学意义(P=0.010,P=0.011);其余各组比较,差异均无统计学差异(P>0.05)。病理切片示,c-Met的表达在HGF 40 ng组最多,其次为HGF 100 ng组,再次20 ng组,表达最少的为阴性对照组和PBS组。各组VEGF-C的表达病理染色切片见图 2。
HGF为间质细胞分泌的一种生长因子,属于纤维蛋白溶解酶原-凝血酶原基因超家族,其与上皮细胞上的特异性受体结合后发挥其生物活性。研究发现,HGF及其受体在口腔鳞癌患者中存在异常表达[10-11]。c-Met为HGF蛋白受体,为酪氨酸激酶家族成员[12]。当HGF与c-Met结合导致后者发生磷酸化后,其下游多个信号通路接着被激活,包括Src/FAK,P13K/Akt,Ras/MAPK等[13]。这些信号通路与VEGF-C及淋巴管生成相关主要有P13K/Akt和MEPK 2 种信号通路[14]。而VEGF-C是目前公认的淋巴管生成因子,其表达与淋巴管的生成密切相关[15-16]。本课题组的前期研究也表明在OSCC中,癌旁的淋巴管密度与c-Met和VEGF-C的表达密切相关[17]。
图 2 裸鼠肿瘤HGF、c-Met、VEGF-C蛋白的表达 (IHC, ×400)
该研究结果提示不同浓度的HGF对荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响不同,在HGF 40 ng组肿瘤中HGF、c-Met及VEGF-C的表达最高,这与之前的研究结果一致[18],即在Tca8113细胞培养中,HGF=40 ng/ml时VEGF-C浓度达到峰值,其促进肿瘤生长的作用最明显。HGF 20 ng组与HGF 100 ng组中,VEGF-C的表达下降。该研究中HGF干预前后肿瘤的体积、瘤重及破溃情况差异不明显,这可能与HGF干预时间短有关,HGF干预时间为5 d,53.13%的肿瘤出现破溃,故未再进一步进行HGF干预。
肿瘤生长速度大于血管生长速度,导致肿瘤出现破溃。该研究中,阴性对照组与PBS组肿瘤破溃率为62.50%和83.33%,肿瘤破溃比率高,在HGF干预组,肿瘤破溃比率分别为HGF 20 ng组50%,HGF 40 ng组50%,HGF 100 ng组16.67%,可能为HGF促进肿瘤血管生成有关,有研究显示,HGF能够促进肿瘤血管的再生[19],这与该研究的结果一致。
该研究也存在一定的不足。样本量不够大。另外,因肿瘤破溃,HGF干预时间不够长,未进行进一步的HGF/c-Met下游多个信号通路抑制试验研究,这些通路包括包括Src/FAK,the p120/STAT3,P13K/Akt,Ras/MAPK等。本研究未使用基因沉默等技术切断HGF/c-Met与VEGF-C之间的分子联系,未抑制HGF/c-Met-VEGF-C引导的OSCC淋巴转移。之后的研究将使用基因沉默技术,进一步研究HGF/c-Met对VEGF-C的影响及对肿瘤的转移、分化、淋巴管生成进行研究。进一步明确HGF对口腔鳞癌的作用及其分子机制。