肝细胞生长因子对口腔鳞癌裸鼠移植瘤的作用及其机制研究

杜洪亮 何等旗 于涛 车银富 陶峰 李阳

肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一种生理状态下由间质细胞产生的具有多功能的细胞生长因子，其与受体c-Met结合后，发挥多种生物学作用，包括促进多种肿瘤细胞的增殖、分化、转移、刺激新生血管及淋巴管生成等[1-3]。有研究发现，HGF促进肿瘤转移是通过其受体c-Met起作用的[4]。另有研究表明，HGF在肿瘤中的表达与VEGF-C的表达相关[5]。但HGF调控肿瘤细胞增殖、分化的具体机制尚不清楚。

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，以局部侵袭和淋巴转移为特点[6]。口腔鳞癌患者存在HGF及受体c-Met的高表达[7]，但HGF对口腔鳞癌患者的效应及其机制尚不清楚。有研究发现，口腔鳞癌患者HGF的增高与VEGF-C的表达有关[8]。本研究通过口腔鳞癌裸鼠移植瘤模型，观察不同剂量HGF对口腔鳞癌裸鼠肿瘤生长的效应，并探讨其作用机制，为口腔鳞癌的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 BALB/c-nu/nu裸鼠36 只，5 周龄，雌雄兼用，体重18～30 g(上海实验动物中心提供)。瘤株：人舌鳞癌细胞株Tca8113由四川大学华西口腔疾病研究国家重点实验室提供。

1.1.2 主要试剂与仪器 HGF(Peprotech，美国)；兔抗多克隆抗体HGF、c-Met(Santa Cruz Biotechnology，美国)；VEGF-C(Zymed,美国)；DMEM高糖培养基、MEM培养基、胎牛血清(Hyclone，美国)；高速冷冻离心机(Sigma，Sigma 3-18K，德国)；CO2恒温细胞培育箱(Heraeus，德国)；超净工作台(Nuaire,美国)；OLYMPUS IX71倒置相差显微镜(Olympus,美国)，微量移液枪(Eppendorf公司，德国)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立 32 只裸鼠皮下接种Tca8113细胞悬液0.1 ml，浓度为5×106/0.1 ml。接种后2 周，肿瘤直径达0.2～0.5 cm，将荷瘤裸鼠随机分为5 组，阴性对照组8 只，其余各组6 只。

1.2.2 实验分组 将口腔鳞癌裸鼠移植瘤模型裸鼠32 只，随机分为5 组：①阴性对照组：8 只，不做任何处理；②B组：6 只，瘤内注射PBS 50 μl；③HGF 20 ng组：5 只，瘤内注射HGF 20 ng/d；④HGF 40 ng组：5 只，瘤内注射HGF40 ng/d；⑤HGF 100 ng组：5 只，瘤内注射HGF 100 ng/d。注射1 次/d，连续给药5 d后，第6天测肿瘤体积，取瘤块，称瘤重。

1.2.3 移植瘤生长情况评价 肿瘤体积：测量肿瘤最长径(a)及与之垂直的最短径(b)，按公式V=0.5×a×b2计算肿瘤体积[9]。观察肿瘤体积变化。

肿瘤重量：连续给药5 d后，第6天脱臼处死小鼠，小心剥离瘤体，称重。

1.2.4 荷瘤小鼠移植瘤HGF、c-Met及VEGF-C的表达测定 采用免疫组织化学法，用兔抗人多克隆抗体HGF(1∶100稀释)免疫染色检测HGF的表达，兔抗人多克隆抗体c-Met(1∶100稀释)免疫染色检测c-Met的表达，兔抗人多克隆抗体VEGF-C(1∶100稀释)免疫染色检测VEGF-C的表达， 染色依照试剂盒说明书进行。

1.3 结果判读

HGF的表达定位于细胞膜及细胞质呈棕黄色颗粒为阳性。c-Met的表达主要位于细胞膜和细胞质，VEGF-C的表达以细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表达，胞浆透明或无色为阴性。每张病理切片计数10 个高倍镜下阳性细胞的数目。免疫组化染色的评估由2 名病理科医师采用盲法分别独立进行。首先进行定性分析抗体染色表达模式的差别，然后进行定量分析。两名病理医师判断的差别通过讨论解决。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 口腔鳞癌裸鼠移植瘤模型建立情况

36 只裸鼠有32 只成瘤，成瘤率为88.89%。皮下接种Tca8113细胞悬液2 周后，裸鼠皮下明显可见瘤体生长，约0.2～0.5 cm大小。实验全程无裸鼠死亡。

2.2 肿瘤体积、瘤重及破溃情况

荷瘤裸鼠荷瘤情况及肿瘤破溃见图 1。分组后各组荷瘤裸鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。肿瘤体积在注射HGF前和注射HGF后以及肿瘤质量各组之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。肿瘤破溃情况各组之间差异无统计学意义(P>0.05)(表 1)。

图 1 荷瘤裸鼠荷瘤情况及肿瘤破溃情况

表 1 裸鼠肿瘤体积、瘤重及肿瘤破溃情况

2.3 肿瘤HGF、c-Met及VEGF-C的表达

肿瘤HGF、c-Met及VEGF-C的表达结果见表 2。

荷瘤裸鼠肿瘤HGF的表达在HGF 40 ng组和HGF 100 ng组明显增高。HGF 40 ng组与阴性对照组相比，差异具有统计学意义(P=0.046),与PBS组相比差异具有统计学意义(P=0.049)；HGF 100 ng组与阴性对照组及PBS组相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)；但HGF 40 ng组与HGF 100 ng组之间的差别不明显(P=0.723)。病理切片同样显示，HGF蛋白的表达在HGF 40 ng组和HGF 100 ng组最多，其次为HGF 20 ng组，表达最少的为阴性对照组和PBS组。各组HGF的表达病理染色切片见图 2。

表 2 肿瘤HGF、c-Met及VEGF-C的阳性细胞数Tab 2 Positive cell count of the expression of HGF、c-Met and VEGF-C in the tumor of the groups

注： ①HGF 40 ng组与阴性对照组比较,P=0.046; ②HGF 40 ng组与PBS组比较,P=0.049; ③HGF 100 ng组与阴性对照组比较,P=0.020; ④HGF 100 ng组与PBS组比较,P=0.021; ⑤HGF 40 ng组与阴性对照组比较,P=0.023; ⑥HGF 40 ng组与PBS组比较,P=0.023; ⑦HGF 100 ng组与阴性对照组比较,P=0.002; ⑧HGF 100 ng组与PBS组比较,P=0.002; ⑨HGF 40 ng组与阴性对照组比较,P=0.01; ⑩HGF 40 ng组与PBS组比较,P=0.011

荷瘤裸鼠肿瘤c-Met的表达在HGF 40 ng组和HGF 100 ng组明显增高。HGF 40 ng组与阴性对照组及PBS组相比，差异均具有统计学意义(P=0.023)；HGF 100 ng组与阴性对照组及PBS组相比，差异均均具有统计学意义(P=0.002)。病理切片同样显示，c-Met的表达在HGF 40 ng组和HGF 100 ng组最多，其次为HGF 20 ng组，表达最少的为阴性对照组和PBS组。各组c-Met的表达病理染色切片见图 2。

荷瘤裸鼠肿瘤VEGF-C的表达在HGF 40 ng组最多。HGF 40 ng组与阴性对照组及PBS组相比，差异均具有统计学意义(P=0.010，P=0.011)；其余各组比较，差异均无统计学差异(P>0.05)。病理切片示，c-Met的表达在HGF 40 ng组最多，其次为HGF 100 ng组，再次20 ng组，表达最少的为阴性对照组和PBS组。各组VEGF-C的表达病理染色切片见图 2。

3 讨 论

HGF为间质细胞分泌的一种生长因子，属于纤维蛋白溶解酶原-凝血酶原基因超家族，其与上皮细胞上的特异性受体结合后发挥其生物活性。研究发现，HGF及其受体在口腔鳞癌患者中存在异常表达[10-11]。c-Met为HGF蛋白受体，为酪氨酸激酶家族成员[12]。当HGF与c-Met结合导致后者发生磷酸化后，其下游多个信号通路接着被激活，包括Src/FAK，P13K/Akt，Ras/MAPK等[13]。这些信号通路与VEGF-C及淋巴管生成相关主要有P13K/Akt和MEPK 2 种信号通路[14]。而VEGF-C是目前公认的淋巴管生成因子，其表达与淋巴管的生成密切相关[15-16]。本课题组的前期研究也表明在OSCC中，癌旁的淋巴管密度与c-Met和VEGF-C的表达密切相关[17]。

图 2 裸鼠肿瘤HGF、c-Met、VEGF-C蛋白的表达 (IHC, ×400)

该研究结果提示不同浓度的HGF对荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响不同，在HGF 40 ng组肿瘤中HGF、c-Met及VEGF-C的表达最高，这与之前的研究结果一致[18]，即在Tca8113细胞培养中，HGF=40 ng/ml时VEGF-C浓度达到峰值，其促进肿瘤生长的作用最明显。HGF 20 ng组与HGF 100 ng组中，VEGF-C的表达下降。该研究中HGF干预前后肿瘤的体积、瘤重及破溃情况差异不明显，这可能与HGF干预时间短有关，HGF干预时间为5 d，53.13%的肿瘤出现破溃，故未再进一步进行HGF干预。

肿瘤生长速度大于血管生长速度，导致肿瘤出现破溃。该研究中，阴性对照组与PBS组肿瘤破溃率为62.50%和83.33%，肿瘤破溃比率高，在HGF干预组，肿瘤破溃比率分别为HGF 20 ng组50%，HGF 40 ng组50%，HGF 100 ng组16.67%，可能为HGF促进肿瘤血管生成有关，有研究显示，HGF能够促进肿瘤血管的再生[19]，这与该研究的结果一致。

该研究也存在一定的不足。样本量不够大。另外，因肿瘤破溃，HGF干预时间不够长，未进行进一步的HGF/c-Met下游多个信号通路抑制试验研究，这些通路包括包括Src/FAK，the p120/STAT3，P13K/Akt，Ras/MAPK等。本研究未使用基因沉默等技术切断HGF/c-Met与VEGF-C之间的分子联系，未抑制HGF/c-Met-VEGF-C引导的OSCC淋巴转移。之后的研究将使用基因沉默技术，进一步研究HGF/c-Met对VEGF-C的影响及对肿瘤的转移、分化、淋巴管生成进行研究。进一步明确HGF对口腔鳞癌的作用及其分子机制。