基于高通量测序技术的新疆传统干奶酪乳酸菌多样性分析

赵顺先，关统伟，向慧平，张国栋，张习超，欧梦莹，林宜锦，王鹏昊

（西华大学微生物研究所/食品生物技术四川省高校重点实验室，成都 610039）

干奶酪是一种营养价值极高的奶制品，新疆本地人称“酸奶疙瘩”。其工艺大致可以归为原料、杀菌、接菌发酵、后熟、分离乳清、干燥成型等步骤。干奶酪根据其水分的含量可以分为特硬质干奶酪、硬质干奶酪、半硬质干奶酪、半软质干奶酪和软质干奶酪[1]。干奶酪中含有丰富的乳酸菌，膳食干奶酪可以预防龋齿、强健骨骼、减少慢性疾病的发生[1-2]。乳酸菌（Lactic acid bacteria）是个种类繁多的微生物集体，目前包括Lactobacillus、Bifidobacterium、Pediococcus、乳球菌属（Lactococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、Weissella、肉食杆菌属（Carnobacterium）、明串珠菌属（Leuconostoc）、链球菌属（Streptococcus）、四联球菌属（Tetragenococcus）、气球菌属（Aerococcus）、漫游球菌属（Vagococcus）等 43 个属，而且每年都有新的种属被不断分离和发现[3]。乳酸菌能赋予食品柔和的酸味和香气，改善食品的品质和营养[4]。还具有降低胆固醇、防止乳糖不耐受症、止腹泻、抗肿瘤、抗变异原、增强免疫力、清除自由基和延缓衰老等重要功能[5-6]。乳酸菌代谢产生的抑菌物质可延缓食品腐败、延长食品货架期，被认为是最适合的食品天然防腐剂[7]。

高通量测序技术是现代生命科学研究的核心技术之一，它实现了同时对几百万DNA分子测序的可能性，达到鉴定微生物的单一基因或全基因组的目的。高通量测序通常是指具有代表性的454焦磷酸测序技术（Roche公司）、Solexa技术（Illumina公司）和SOLiD技术（ABI公司）[8]，是环境微生物群落组成和多样性研究的主流方法。目前，国内基于高通量测序探索干奶酪中乳酸菌多样性的研究并不多，本实验16S rDNA测序采用Illumina公司的Hiseq测序技术平台，具有高通量、高精度、极佳重现性和测序成本低等优点，从而很好的探测新疆传统干奶酪中乳酸菌的多样性，为区域性特色乳酸菌资源的挖掘提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

干奶酪样品取自新疆库尔勒、额敏、乌鲁木齐、伊犁4个地区，每个地区随机选择3个地点取样。样品X1、X2和X3采集自库尔勒，样品X4、X5和X6采集自额敏，样品X7、X8和X9采集自乌鲁木齐，样品X10、X11和X12采集自伊犁，采集到的样品用真空包装袋密封储藏运输。本研究采集的12份新疆不同地区的干奶酪，其水分都在25%以下，属于特硬质干奶酪，其制作方法大致相同。

1.2 主要试剂与仪器

DNeasy PowerSoil试剂盒，Qiagen 公司；Omega凝胶提取试剂盒，Omega Bio-Tek公司；DNA PCRFree样品制备试剂盒，TruSeq公司；Hiseq Rapid SBS Kit v2测序试剂盒，Illumina公司；硫酸钾、硫酸铜、硫酸、硝酸、浓盐酸等试剂均为分析纯，成都市科龙化工试剂公司；

Qubit@2.0，Thermo Scientific；NanoDrop 分光光度计，Thermo Scientific；Applied Biosystems® Gene Amp® PCR System 9700，ABI公司；SH420 石墨消解仪、K1100自动凯氏定氮仪、S402废弃吸收系统，海能仪器有限公司；AA6880型原子分光光度计，日本岛津公司；100 g多功能粉碎机，上海市蒲恒信息科技有限公司；可调式电热板，武汉格莱莫检测设备有限公司；PHS-3C pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 理化指标检测方法

干奶酪粉碎，过400目筛、混匀，保存备用。

蛋白质测定，参照GB 5009.5-2016，利用K1100自动凯氏定氮仪进行（氮换算为蛋白质的系数为6.38）。水分含量，参照GB 5009.3-2016检测干奶酪中的水分含量。钙含量，参照GB 5009.92-2016，利用AA6880型原子分光光度计测定。脂肪，参照GB 5009.6-2016，利用SOX406脂肪测定仪检测。酸度，参照GB 5009.239-2016对干奶酪中的酸度进行测定。pH的测定，称取10 g干奶酪粉末，加入100 mL新煮沸冷却至室温的水，静置30 min，使用pH计进行测定。

1.4 样品总DNA的提取和PCR扩增

使用DNeasy PowerSoil试剂盒提取样品中总DNA，用NanoDrop分光光度计检查DNA浓度和质量。PCR扩增采用Biosystems®Gene Amp®PCR System 9700 扩增仪。引物：515F（5′-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和 806（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。PCR 混合物（25 μL）含有 1×PCR 缓冲液，1.5 mmol/L MgCl2，0.4 μmol/L 脱氧核苷三磷酸，1.0 μmol/L各引物，0.5U KOD-Plus-Neo（TOYOBO）和10 ng模板DNA。PCR扩增程序由94℃初始变性1 min，随后30个循环（94℃变性20 s，54 ℃退火 3 s，72 ℃延伸 30 s），最后延伸在 72 ℃下5 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，用OMEGA胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，OMEGA凝胶提取试剂盒纯化电泳带。

1.5 文库构建及测序

使用Illumina公司的TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit试剂盒构建序列文库。在Qubit@2.0荧光计和Agilent Bioanalyzer 2100系统上对测序文库进行评估。将文库应用于Rhonin Biosciences有限公司的Illumina Hiseq装置进行双端测序（2×250 bp）。

1.6 数据分析

使用QIIME中的PyNAST[9]对代表性序列进行比对并去除低质量、接头污染和低复杂的序列，用FLASH[10-11]对有效序列进行拼接，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品。再用UPARSE[11]软件将序列聚类到97%的操作分类单位OTUs[12]。筛选重复序列，使用Uchime[13]软件去除嵌合体[14]。在QIIME中使用Silva database[15]和uclust进行物种分类信息划分，同时去除注释为叶绿体、线粒体以及非乳酸菌的OTU。所有数据分析使用R[16]和Python（https：//www.python.org/）进行。用 Vegan 计算 alpha多样性指标，基于这些指标生成了稀释曲线。相关性分析是寻找研究现象之间是否存在某种依存关系，并对具体有依存关系的现象探讨其相关方向及程度的一种统计方法。具体在生态学研究中相关分析包括环境因子间的自相关、物种间丰度变化的相关性、群落与环境因子的相关性以及物种与环境因子的相关性[17-18]。计算物种丰度与环境因子的相关性及其显著性，结合热图或聚类分析能更好地呈现计算结果[19]。选择Spearman方法计算不同组间各个物种与每个环境因素的相关程度并进行显著性检验，检验水平为95%，并使用BH方法校正p值。使用欧氏距离和层次聚类算法（complete-linkage）对物种进行聚类，然后基于聚类信息使用Heatmap进行结果呈现同时给出显著程度。

2 结果与分析

2.1 干奶酪理化指标测定结果

12个样品中的主要组分测定如表2所示。除X1样品外，其余的11个样品蛋白质含量都比较高，蛋白质含量达到了44.061～57.850 g/100 g，而样品X1的蛋白质含量仅为24.967 g/100 g；脂肪含量最高的样品为X2，其脂肪含量为31.38 g/100 g，X3样品脂肪含量最低，其含量为4.1g/100 g；X4样品水分含量最高，为22.25 g/100 g，X2样品水分含量最低，仅为5.16 g/100 g；样品 X8的 Ca含量最高为980.402 mg/kg，X3 含量最低为 223.172 mg/kg；样品X7的酸度最高，为126.59 mL/100 g，样品X5的酸度最低为71.96 mL/100 g。上述组分的含量测定结果表明新疆传统干奶酪中含有丰富的营养成分。

2.2 样品α多样性分析

α多样性分析可以反映微生物群落的丰度、均匀性及多样性。按照barcode标签区分样品序列，过滤低质量序列。将过滤后的序列与数据库进行比对，去除嵌合体，共得到60 056条有效数据，聚类为715个OTU。基于OTU的分析结果，分别计算Shannon和Chao1指数。利用chao1算法估计样本中所含OTU数目的指数，结果如表2。所有样品观测到的OTUs为59.58±7.73。利用香农-维纳指数估算样本中微生物多样性，Shannon指数整体相差不大（2.58±0.15）。

分别使用Observed、Chao1及Shannon指数进行稀释曲线的制作，结果如图1所示。通过分析Observed 指数稀释曲线，样品 X1、X2、X6、X7、X8、X12的稀释曲线都趋于平缓，表明测序深度充分，OTU的数量接近于饱和，测序深度基本覆盖到样品中所有的物种。样品X10和X11的稀释曲线随着测序深度增加上升趋势较为明显，还需要进一步加大测序深度，以更好地反映其真实情况。分析Chao1指数稀释曲线，样品 X1、X2、X3、X5、X6、X7、X8 的稀释曲线趋于平缓，表明测序深度足以覆盖样品物种总数。另外Shannon曲线都趋于平稳，表明干奶酪中物种总数的测序深度已足够。

表1 干奶酪理化指标测定结果Table 1 Dry cheese physical and chemical indicators

表2 不同样品中α多样性指数Table 2 Alpha diversity index in different samples

2.3 样品间属水平乳酸菌群落结构分析

图1 12份新疆干奶酪乳酸菌类群稀释曲线Figure 1 Rarefaction curves of lactic acid bacteria in 12 Xinjiang dry cheeses

在97%相似水平上对OTU序列进行门、纲、目、科、属、种分类学分析，共得到2个门、2个纲、2个目、7个科、12个属，如图2所示。2个门为厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria），2个纲为芽孢杆菌纲（Bacilli）和放线菌纲（Actinobacteria），2个目为乳杆菌目（Lactobacillales）和双歧杆菌目（Bifidobacteriales），7个科分别为气球菌科（Aerococcaceae）、肉杆菌科（Carnobacteriaceae）、肠球菌科（Enterococcaceae）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）、明串珠菌科（Leuconnstocaceae）、链球菌科（Streptococcaceae）和双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）；12 个乳酸菌属分别为Carnobacterium、Aerococcus、Marinilactibacillus、Lactococcus、Vagococcus、Tetragenococcus、Fructobacillus、Enterococcus、Pediococcus、Weissella、Lactobacillus和Bifidobacterium。其中Lactobacillus、Bifidobacterium、Weissella和Pediococcus是优势菌属（＞1%），占所测得乳酸菌类群的98.65%±1.52%。Lactobacillus在所有样品中含量都为最高，其中库尔勒中的X2样品Lactobacillus占到了76.79%；此外，Bifidobacterium和Weissella分别在额敏的 X4（27.18%）和 X5（14.74%）样品中所占的比例最大；在伊犁的X11中Pediococcus所占比例为（4.04%）。另外，库尔勒样品中没有检测到Carnobacterium和Marinilactibacillus；额敏样品中只检测到8个属，没有检测到Tetragenococcus、Vagococcus、Lactococcus和Carnobacterium；伊犁样品中没有检测到Vagococcus、Marinilactibacillus和Aerococcus；乌鲁木齐样品中囊括12个菌属，其中X9的乳酸菌属就达到了11个属，在所有样品中是最丰富的。

2.4 样品间种水平乳酸菌多样性分析

种水平上测定到9种优势乳酸菌菌种（＞1%），9种乳酸菌可归为6个属。乳杆菌属有Lactobacillus bucbneri、Lactobacillus paracollinoides和Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus。Pediococcus有Pediococcus damnosus和Pediococcus ethanolidurans。其他4个菌属各有一种，分别为短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）、类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、Leuconostoc mesenteroides、Tetragenococcus halophilus。对这9种乳酸菌种进行水平聚类热图分析，如图3所示，干奶酪样品中短双歧杆菌和类肠膜魏斯氏菌中含量最丰富。其中，Bifidobacterium breve和Weissella paramesenteroides分别在额敏的X4（26.39%）和 X5（14.20%）中所占的比例最大。另外，只在乌鲁木齐X9中鉴定到具有较高丰度的Leuconostoc mesenteroides（1.67%）和Tetragenococcus halophilus（1.32%）。

2.5 乳酸菌类群与干奶酪养分组成相关性分析

选择Spearman方法对样品中的理化成分与乳酸菌类群进行关联性分析，其结果用热图展示。如图4所示，Lactobacillus受脂肪的影响较大（P＜0.01），呈正相关；Bifidobacterium受脂肪和水分的影响都比较显著，脂肪对其的影响呈负相关（P＜0.05），水分对其影响为正相关（P＜0.05）；Weissella受水分的影响比较显著，呈负相关（P＜0.05）；Marinilactibacillus受 Ca的影响比较显著（P＜0.05）。Pediococcus受蛋白质的影响较大，呈负相关（P＜0.05）。Tetragenococcus受pH和酸度的影响都比较显著，pH对其影响呈正相关（P＜0.05），酸度对其影响呈负相关（P＜0.05）。

图2 12份新疆干奶酪中属水平乳酸菌菌群分布Figure 2 12 samples of Xinjiang cheese lactic acid bacteria in the genus level distribution

图3 12份新疆干奶酪中乳酸菌种水平类群聚类热图Figure 3 Cluster heat map of lactic acid bacteria in 12 Xinjiang dry cheeses

3 讨论

近年来，乳酸菌作为益生菌广泛应用于食品及药品领域中，含有大量乳酸菌的乳制品是营养与保健功能兼备的现代人的理想食品之一[20]。本研究应用lllumina高通量测序技术分析12份新疆干奶酪中乳酸菌的多样性，探讨了干奶酪中乳酸菌群落结构组成。挖掘到的乳酸菌可归为2个目7个科12个属，其中Lactobacillus、Bifidobacterium、Weissella和Pediococcus是优势菌属，占到所测得乳酸菌类群的98.65%±1.52%。同国内外奶酪中的优势乳酸菌属相比，存在一定差异。呼斯楞[21]和Masoud等[22]分别对哈萨克斯坦传统奶酪和丹麦的Danish raw milk奶酪中的乳酸菌分析发现，其优势菌属均为Lactobacillus、Lactococcus和Streptococcus，段宇珩等[23]从青海曲拉中检测到的优势菌属为Leuconostoc、Enterococcus、Lactobacillus。另外，本研究在库尔勒样品中没有检测到Carnobacterium和Marinilactibacillus；额敏样品中只检测到8个属，没有检测到Tetragenococcus、Vagococcus、Lactococcus和Carnobacterium；伊犁样品中没有检测到Vagococcus、Marinilactibacillus和Aerococcus；乌鲁木齐样品中囊括12个菌属，其中X9的乳酸菌属就达到了11个属，在所有样品中是最丰富的。

在种水平上检出的9种优势乳酸菌种分别为Lactobacillus bucbneri、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus、Pediococcus damnosus、Pediococcus ethanolidurans、Bifidobacterium breve、Weissella paramesenteroides、Leuconostoc mesenteroides和Tetragenococcus halophilus。其中Bifidobacterium breve和Weissella paramesenteroides的丰度较高，其分别来自于双歧杆菌属和魏斯氏菌属。另外，只在乌鲁木齐X9中鉴定到具有较高丰度的Leuconostoc mesenteroides（1.67%）和Tetragenococcus halophilus（1.32%）。而爱尔兰奶酪中的优势菌种来自乳球菌属[24]，丹麦原奶酪中的优势菌种来自乳杆菌属和链球菌属[25]，马苏里拉奶酪中的优势菌种来自嗜热链球菌属[26]。El-Baradei等[27]和张蓓[28]分别对埃及Domiati奶酪和藏族传统曲拉中乳酸菌检测分析，Leuconostoc mesenteroides均为优势菌，包秋华[29]从曲拉中检测到的优势菌为Lactobacillus helveticus。此外，类肠膜魏斯氏菌在国内外的奶酪制品中鲜有报道。

物种干奶酪内环境关性分析表明，Weissella受水分的影响较大，Bifidobacterium受脂肪和水分的影响较显著，Tetragenococcus受pH和酸度的影响也比较显著，Lactobacillus受脂肪的影响较大，Marinilactibacillus受Ca的影响比较显著，Pediococcus受蛋白质的影响较大。环境关联性分析表明多种因素共同影响着新疆干奶酪乳酸菌多样性。另外，本研究得到的优势菌种Bifidobacterium breve是肠内的益生菌群，具有抑制肠道病原菌生长、改善蛋白质代谢、提供维生素、降低胆固醇、提高免疫机能和抗氧化等生理功能[30-32]，还可以帮助早产儿吸收人乳寡糖[33]。在后续实验中可以着重对优势菌株和产脂肪酶乳酸菌进行筛选，并探究其功能性。

本研究通过对干奶酪中优势乳酸菌多样性的认识及环境相关性的分析，可为今后挖掘有商业价值的区域性特色乳酸菌提供参考依据，从而更好地促进我国土著乳酸菌资源开发的深度与广度。