黄芪多糖对鸡淋巴细胞体外增殖及脾脏淋巴细胞分泌细胞因子和相关mRNA表达的影响

朱轶锋，韩顺顺，张克英，尹华东*

（1.四川农业大学动物营养所，成都 611130；2.四川农业大学动物科技学院，成都 611130）

随着物质生活水平的不断提高，人们对鸡肉的需求已经从数量上追求转变为质量上满足。为降低肉鸡规模化、集约化养殖带来的疫病影响，越来越密集的免疫程序以及药物滥用导致鸡肉中药物和抗生素残留不断增加，动物机体耐药性日益升高，对生态环境带来了深层次污染，更对人类健康造成威胁。寻找安全、环保、高效的免疫调节剂代替传统药物已成为畜牧业关注的热点[1]。

近年来的大量研究证明，中药多糖尤其是补益类多糖可提高机体免疫器官质量，增强动物机体免疫功能，且具有安全、无毒、无残留等优点，是一类优良的生物反应调节剂[2-3]。因此，采用多糖类天然产物来提高动物免疫能力，减少免疫次数，降低药物残留，越来越受到畜牧行业的重视。

黄芪是常用的扶正固本，补中益气类中草药。黄芪多糖（Astragaluspolysaccharides，APS）是从黄芪根部分离出的多糖物质，为发挥其免疫增强作用的主要成分。黄芪多糖可调节动物血压和血糖，增强机体免疫力，还具有抗病毒、抗氧化、防衰老的作用[4-5]。大量研究表明，黄芪多糖可激活机体内淋巴细胞，引起特异性免疫应答反应，还可激活巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等免疫细胞以及诱导分泌细胞因子从而激活非特异性免疫应答反应[6-8]。

现代中药药理学研究表明，中药对动物的免疫调节具有浓度效应，只有在最适浓度下才能发挥最佳功效，且针对不同动物机体，可表现出相异的促进或抑制免疫作用[9]。因此，本试验以不同浓度的APS处理体外培养的雏鸡外周血、胸腺、脾脏以及法氏囊淋巴细胞，通过MTT比色法检测不同淋巴细胞体外增殖情况，以及采用ELISA和RT-qPCR分别检测脾脏淋巴细胞中细胞因子IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4、IL-6含量及其相关基因 mRNA 表达量，旨在从细胞水平和分子水平探讨黄芪多糖对家禽的免疫调节机制，为其在优质鸡生产中的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1日龄ROSS 308肉鸡，购买于四川玉冠农业有限公司。黄芪多糖购买于某动物药业公司，纯度98.5%。采用不含小牛血清的RPMI-1640培养液溶解 APS，分别配制浓度为 20、40、80、160 以及320 μg/mL的APS溶液，微孔滤膜过滤器除菌后，4℃保存待用。

1.2 试验方法

1.2.1 外周血、胸腺、法氏囊以及脾脏淋巴细胞的分离与制备

在7日龄选取健康雏鸡6只，心脏无菌采血5 mL，肝素钠抗凝后1∶1（V/V）加入40%percoll分层液（Pharmacia公司），再加入70%percoll分层液，3 000 r/min离心15 min，小心吸取两层之间的白色单核淋巴细胞层吸出，Hanks液洗3次（每次1 000 r/min，离心5min）后加入RPMI-1640完全培养液（GIBCO公司），细胞浓度为2×106个/mL，采用台盼蓝染色检测细胞存活率。

鸡颈部静脉放血致死，新洁尔灭溶液浸泡3 min，无菌取出胸腺、法氏囊和脾脏，PBS冲洗3次后剔除脂肪组织和包膜，放入装有Hanks液的器皿中剪碎。用灭菌后的玻璃试管底部在100目的细胞筛网上研磨过滤，收集细胞悬液于40%percoll分层液中，再缓慢加入到70%percoll分层液之上，3 000 r/min离心15min，小心将两侧白色的单核淋巴细胞层吸出，后操作步骤同上。

1.2.2 淋巴细胞的培养及增殖情况测定

用96孔细胞培养板进行淋巴细胞的体外培养。将50 μL细胞培养液、50 μL浓度为5 μg/mL的有丝分裂原（刀豆蛋白液，ConA）以及50 μL不同浓度（20、40、80、160、320 μg/mL）APS，对照组加入 50 μL RPMI-1640培养液（APS浓度为 0 μg/mL），每个处理设置3个重复。将混合液轻微震荡混匀，放置于37℃，5%的CO2培养箱中培养72 h，每孔加入10 μL MTT后继续培养4 h，2 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入相同量不含鸡血清的RPMI-1640培养液，同时每孔添加10 mg/mL MTT溶液10 μL，振荡混匀后继续培养4 h。随后，每孔加入100 μL DMSO，充分振荡混匀后静置20 min，用酶联免疫检测仪（Bio-RAD iMark）在570 nm波长处测定吸光度值（OD值）以判定细胞的增殖程度。

1.2.3 脾脏淋巴细胞中细胞因子含量的测定

脾脏淋巴细胞培养及处理同上，收集培养48 h后的细胞培养上清液，采用ELISA试剂盒（上海博谷生物）测定脾脏淋巴细胞淋巴因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-β以及IFN-γ的含量，具体测定过程按试剂盒提供的说明书进行操作。根据标准品浓度及对应OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在直线回归方程上计算出相对应的样品浓度。

1.2.4 细胞RNA提取、反转录及荧光定量检测

采用RNAiso Plus（TaKaRa）试剂按照说明书提取淋巴细胞总RNA，DNaseⅠ纯化处理后，1%琼脂糖凝胶和Nanodrop ND-1000检测RNA的完整性和浓度，随后采用PrimeScriptTMRT反转录试剂盒（TaKaRa）将RNA反转录为cDNA，保存于-20℃备用。

采用Smart Cycler II（Cepheid）实时PCR系统进行基因实时定量扩增，反应总体系25 μL，包括灭菌的 ddH2O 8.5 μL，cDNA 模板 2 μL，上下游引物（表 1）各 1 μL（10 μmol/L），SYBRPremix Ex TaqTM-Ⅱ（2×）12.5 μL。采用两步法PCR反应程序：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环。选用GAPDH作为内参基因，2-ΔΔct法计算基因相对表达量。

1.3 数据统计与分析

试验数据以均值标准误表示，SPSS18.0软件中的One-way ANOVA进行方差分析，Duncan’s法进行多重比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

表1 荧光定量PCR引物Table 1 Primers sequences of RT-qPCR

2 结果与分析

2.1 APS显著影响鸡不同组织淋巴细胞体外增殖

由表1可知，与对照组相比，添加浓度为20 μg/m的APS对外周血、胸腺、法氏囊以及脾脏淋巴细胞体外增殖没有影响（P＞0.05）。当APS浓度增加到40 μg/m以上，除胸腺外，外周血、法氏囊以及脾脏淋巴细胞各处理组OD值均显著高于对照组（P＜0.05）。外周血淋巴细胞的OD值在160 μg/m和320 μg/m的APS处理组之间没有差异（P＞0.05）；在法氏囊和脾脏淋巴细胞中，160 μg/m处理组的OD值显著高于 320 μg/m处理组（P＜0.05）。80 μg/m及以上浓度APS处理显著提高胸腺淋巴细胞OD值（P＜0.05），其中160 μg/m APS效果最佳，OD值显著高于其他5个处理组（P＜0.05）。

2.2 APS显著影响鸡脾脏淋巴细胞因子的分泌

由表3可知，浓度为20 μg/mL的APS处理组中，脾脏淋巴细胞中分泌的Th1型细胞因子IL-2、TNF-β、IFN-γ 和 Th2型细胞因子 IL-4、IL-6 含量与对照组相比，差异均不显著（P＞0.05）。当APS浓度提高至40 μg/mL以上后，4个处理组中IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4 和 IL-6 的含量均显著高于对照组（P＜0.05）。IL-2、IFN-γ、IL-4的含量在 APS添加浓度为160 μg/mL时达到最高水平，显著高于其他处理组（P＜0.05），80 μg/mL的 APS处理组中，这3个细胞因子的含量也显著高于40 μg/mL和320μg/mL处理组（P＜0.05）。TNF-β和IL-6的含量在160 μg/mL和320 μg/mL处理组间没有差异（P＞0.05），但都显著高于 40 μg/mL 和 80 μg/mL 处理组（P＜0.05），处理浓度为 80 μg/mL时，IL-6的含量显著高于 40 μg/mL（P＜0.05），但 TNF-β 含量在这两个处理之间没有差异（P＞0.05）。

表2 黄芪多糖对鸡脾脏淋巴细胞增殖的影响Table 2 The effect of APS on the proliferation of lymphocyte in spleen of chicken

表3 黄芪多糖对鸡脾脏淋巴细胞因子含量的影响Table 3 The effect of APS on the lymphokines content in splenic lymphocytes of chicken

2.3 APS显著影响鸡脾脏淋巴细胞因子基因mRNA表达量

由表4可知，浓度为20 μg/mL的APS添加对脾脏淋巴细胞中IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4、IL-6基因mRNA表达量影响不显著（P＞0.05）。APS浓度提高至 40 μg/mL 时，TNF-β、IFN-γ和IL-6基因mRNA显著高于对照组（P＜0.05）。细胞中APS浓度大于超过 40 μg/mL，IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4、IL-6基因mRNA表达量均显著高于对照组（P＜0.05），其中160 μg/mL效果最佳（P＜0.05）。此外，当APS浓度达到 320 μg/mL，IFN-γ、IL-4和IL-6基因 mRNA表达显著低于80 μg/mL处理组（P＜0.05）。

2.4 APS显著影响鸡脾脏淋巴细胞表达转录因子mRNA表达量

由表5可知，脾脏淋巴细胞中核转录因子TBX21和Gata-3的mRNA表达量在APS添加浓度为20 μg/mL时，与对照相比没有显著差异（P＞0.05）。APS浓度提高40 μg/mL后，4个处理组中TBX21和Gata-3的mRNA表达量均显著高于对照组，其中TBX21的mRNA表达量在APS浓度为160 μg/mL的处理组中最高，显著高于其他处理组（P＜0.05）；Gata-3的mRNA表达量在160 μg/mL和320 μg/mL处理组中没有差异（P＞0.05），但都显著高于40 μg/mL和80 μg/mL处理组（P＜0.05）。

3 讨论

淋巴细胞是免疫系统的核心组成，是机体最重要的免疫细胞，淋巴细胞的增殖和分化是机体在免疫应答过程中最重要的阶段，其增殖程度是反映机体细胞免疫水平的一个重要指标[10]。近年来研究表明，APS具有促进淋巴细胞的增殖与分化，增加胞浆细胞分泌、提高血清抗体浓度、调节淋巴细胞亚群平衡等作用。王德云等[11]的研究发现浓度为150 μg/mL的APS协同ConA刺激鸡脾脏淋巴细胞增殖的效果最好，且具有量效关系。邱妍[12]采用5个浓度的APS（50、100、200、400 以及 800 μg/mL）对鸡脾脏淋巴细胞进行体外培养后发现，APS可单独或协同ConA促进淋巴细胞增殖，其中以100 μg/mL浓度最佳。章世元等[13]研究证明，一定浓度的APS能显著促进肉仔鸡脾脏和血液中B和T淋巴细胞增殖，与邱妍的报道一致，也是浓度100 μg/mL时促进效果最明显。范云鹏等[14]报道，用APS制备的脂质体在15.625～125 μg/mL时可单独或与植物血凝素作用显著提高鸡B和T淋巴细胞增殖效率。本试验结果发现APS对鸡外周血、胸腺、脾脏和法氏囊中淋巴细胞增殖效率的影响同样具有浓度效应，160 μg/mL的APS可显著促进4个组织淋巴细胞增殖，提示在该浓度下APS可提高细胞免疫水平。

表 4 黄芪多糖对鸡脾脏淋巴细胞淋巴因子基因mRNA表达量的影响Table 4 The effect of APS on the mRNA expression of lymphokines gene in splenic lymphocytes of chicken

表5 黄芪多糖对鸡脾脏淋巴细胞表达转录因子mRNA表达量的影响Table 5 The effect ofAPSonthe mRNA expressionof transcriptionfactor insplenic lymphocytes ofchicken

细胞因子是由T淋巴细胞、B淋巴细胞以及NK细胞等产生的一类具有免疫调节功能的蛋白类物质，为免疫系统中重要的信息分子[15]。辅助性T细胞（helper T cell，Th）对机体的特异性和非特异性免疫均具有重要的调节作用，既能促进其他T细胞的分化成熟，又能协助B细胞产生抗体，按照其所产生的细胞因子种类功能，可分为Th1和Th2型细胞，其中 Th1细胞主要分泌细胞因子 IL-2、IFN-γ、TNF-β，介导细胞免疫，诱导免疫排斥；Th2细胞主要分泌细胞因子 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，参与介导体液免疫通过抑制Th1型免疫反应从而调节免疫耐受性[16]。IL-2由活化的T淋巴细胞产生，可促进Th0和CTL的增殖，也参与抗体反应、肿瘤监视等，为调控免疫应答的重要因子[17]。TNF-β可增强T细胞的增殖以及抗原表达，促进IL-2、IFN-γ等淋巴因子的产生，并可增强有丝分裂原或外来抗原对B细胞的刺激，IFN-γ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，增强细胞免疫功能[18]。IL-4可促使抗原或丝裂原活化的B细胞分裂增殖，刺激CD4+T细胞分化成II型辅助T细胞[19]。IL-6是由T细胞自身分泌的生长因子，其通过促进B细胞的存活而间接影响B细胞的分化[20]。王俊丽[21]的研究结果发现，添加100～400 μg/mL的APS可显著促进肉仔鸡淋巴细胞对IL-2、IL-6以及IFN-γ的分泌，证明APS可以通过调节细胞因子分泌，促进淋巴细胞增殖，进而调节免疫系统功能。赵天章等[22]发现，饲粮中添加APS可提高肉仔鸡血清IL-1、IL-2和TNF-β的含量，以及42龄鸡血清IL-2和TNF-β水平。陈洪亮[23]与刘永杰等[24]的试验同时证明了APS能促进肉仔鸡脾脏淋巴细胞IL-2的分泌，且与APS的添加量相关。然而，目前关于APS对鸡脾脏淋巴细胞因子相关基因表达的影响研究鲜有报道。本试验结果显示，APS对雏鸡脾脏淋巴细胞中Th1细胞因子IL-2、TNF-β、IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4和IL-6含量的影响同样呈现剂量效应，浓度为160 μg/mL时对细胞因子的促分泌作用最显著，在该浓度下，Th1和Th2型5个细胞因子的mRNA表达量也显著高于其他处理组，说明APS可能参与雏鸡细胞免疫调节。

辅助性T淋巴细胞 Th1/Th2细胞之间的相互平衡在免疫应答中起关键作用，是机体免疫调节的重要系统。由TBX21基因编码的转录因子T-bet是Th1型细胞分泌细胞因子的特异性标志，GATA-3是目前确定唯一能调控Th2型细胞因子合成的转录因子[25]。之前的研究已经证明TBX21和Gata-3基因表达调控Th1/Th2细胞分化，从而影响细胞因子分泌。本研究结果显示，APS添加可以显著提高TBX21和Gata-3的mRNA表达量，进一步提示APS可以促进雏鸡淋巴细胞分泌Th1和Th2型细胞因子，且在浓度为160 μg/mL时对这2个基因表达的促进作用最明显。马玉芳等[26]和郑乃珍等[27]分别发现金线莲多糖（ARP）和猴头菇多糖（HEP）能协同ConA诱导核转录因子T-bet和Gata-3基因表达来上调小鼠淋巴细胞Th1、Th2型细胞因子mRNA表达以及促进细胞因子分泌，进而发挥免疫调节作用，本研究的结果与其相似。

4 结论

APS对雏鸡外周血、脾脏、胸腺以及法氏囊中的淋巴细胞体外增殖均有促进作用，APS还能上调脾脏淋巴细胞中Th1和Th2细胞特异性转录因子T-bet和Gata-3的mRNA表达，从而促进Th1细胞因子（IL-2、TNF-β和IFN-γ）以及Th2细胞因子（IL-4和IL-6）分泌，添加浓度为160 μg/mL时效果最为明显。