miR-363靶向调控E2F3表达影响HepG2细胞增殖和凋亡研究*

姜哲，舒敏，王媛媛，朴莲淑

原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）是源于肝细胞和肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，其中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）超过 90%，肝内胆管细胞癌约占4%左右，极少数为肝细胞癌-肝内胆管细胞混合癌[1，2]。全球每年有超过60万人死于 PLC，其中50%发生在中国，且其死亡率一直呈上升趋势[3]。目前，治疗肝癌的有效方法是手术切除、肝移植和辅助放化疗，但大部分肝癌患者首诊时已为晚期，超过50%HCC患者在接受肝切除术后出现肿瘤复发[4]。因此，早期诊断和治疗 HCC，对提高患者手术疗效以及延长生存期具有重要的意义。采用经皮穿刺肝动脉栓塞和生物治疗等干预方法治疗 HCC复发和转移也一直广受关注，但这些方法治疗的效果还有待提高[5，6]。探讨 HCC发生侵袭转移的分子机制，对 HCC的诊断、治疗和预后具有重要的意义。近年来，非编码小分子RNA在HCC侵袭转移中的作用受到研究者的关注。非编码小分子RNA可以从多个层面调控基因的转录和表达，参与机体各种生理病理机制的调控，与多种疾病的发生发展密切相关，对微小核糖核酸（microRNA，miRNA）的研究较为深入。miRNA是一类调控蛋白质编码基因的内源性非编码RNAs，长度为21个核苷酸左右，在真核生物中存在，参与细胞分化、细胞增殖和凋亡等各个过程，也参与肿瘤的发生发展过程[7，8]。miR-363是新近发现的一种miRNA，在肝癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和胃癌等癌组织表达上调，降低miR-363表达能够抑制细胞增殖，但其具体机制还不清楚[9]。研究表明，E2F转录因子3（E2F3）在肝癌细胞高表达，且与 HCC发生密切相关[10]。本研究探讨了miR-363靶向调控HepG2细胞E2F3表达对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器 肝癌细胞HepG2细胞（中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库）、miR-363抑制剂及阴性对照（上海吉玛生物科技有限公司）、DMEM 培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）、超级胎牛血清（武汉普诺赛生命科技有限公司）、胰酶（Gibco公司，美国）、Trizol ReagentRNA提取试剂盒（Invitrogen公司，美国）、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反转录试剂盒（大连TaKaRa公司）、UltraSYBR One Step RNA PCR Kit荧光定量PCR试剂盒（宝生物工程大连有限公司）、miR-363和GADPH引物（大连TaKaRa公司）、四噻唑 蓝 （methyl tihiazolyl tetrazolium，MTT， 美 国Amresco公司）、ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）、细胞蛋白抽提试剂（碧云天生物技术研究所）、鼠抗E2F3、抗Bax、抗Caspase-3单克隆抗体（Santa Cruz公司，型号为SC-526/HZ-4563R，美国）、辣根过氧化物酶HRP标记的亲和纯化山羊抗小鼠IgG、鼠抗GADPH单克隆抗体（武汉艾美捷科技有限公司）、CO2细胞培养箱（Thermo Revco，美国）、NanoDrop2000c 型蛋白核酸检测仪（Thermo公司，美国）、实时荧光定量PCR分析仪和流式细胞仪（BIO-RAD公司，美国）、倒置显微镜（Nikon公司，日本）、BIO-RAD 垂直电泳仪（BD公司，美国）和HBS-1096B酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）。

1.2 细胞培养和实验分组 用含10%超级胎牛血清的DMEM培养液37℃、5%CO2培养HepG2细胞，隔日换液。当细胞处于对数生长期时进行实验。用Lipofectamine法将miR-363抑制剂或阴性对照转染到HepG2细胞，继续培养48 h，收获细胞，进行相关检测。

1.3 HepG2细胞增殖检测 采用MTT法，选择对数生长期HepG2细胞，胰酶消化后调整细胞数，以5×103/孔接种于96孔板，200 μl/孔。各剂量组设3个平行孔，待细胞融合后，弃培养基，用miR-363抑制剂或阴性对照培养48 h，转染到HepG2细胞。加入MTT 50 μl/孔，培养4 h，弃上清液，加入DMSO 200 μl/孔，振荡10 min，检测吸光度值（OD值），计算HepG2细胞增殖率 [细胞增殖率=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）。

1.4 HepG2细胞凋亡检测 使用流式细胞术检测，按照1.2方法处理细胞，消化后按ANNEXIN VFITC/PI凋亡检测试剂盒要求的方法测定HepG2细胞凋亡率。每孔5×105个细胞，各剂量组设3个平行孔。

1.5 HepG2细胞miR-363 mRNA水平检测 采用实时荧光定量RT-PCR法检测，按照1.2方法处理细胞，消化后取5 mL细胞液（细胞数为5×106/mL），5000 r/m离心5 min。根据RNA提取试剂盒操作说明书提取总RNA，测定mRNA浓度和纯度。将提取的总RNA经反转录，合成cDNA。根据SYBR Premix Ex Taq TM II荧光定量PCR试剂盒说明，制备20 μl反应体系，在CFX-96 PCR扩增仪上扩增。反应条件为预变性95℃ 30 s、变性95℃ 5 s、60℃ 44 s，40个循环。采集数据，并对其水平进行分析。

1.6 HepG2细胞E2F3、Bax和Caspase-3蛋白水平检测 采用Western Blot法检测，按照1.2方法处理细胞，消化后，加无血清培养液2 ml，终止消化。5000 r/m 离心 5 min，洗涤 2 次，加入 PMSF 1 μl。根据细胞数，加入细胞蛋白抽提试液，冰浴2 h；4℃、10000 r/m离心15 min，取上清，进行蛋白定量；调整蛋白浓度，加入1/5体积的5×Buffer，沸水中变性，-80℃保存备用。电泳、切胶；先后加一抗和二抗，孵育，采集图像，对免疫印迹条带灰度值进行分析。1.7统计分析 应用SPSS 19.0软件录入数据并进行统计学分析。计量资料以（±s）表示，经方差齐性检验后，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抑制miR-363对HepG2细胞增殖和凋亡的影响 与对照组比较，抑制剂组HepG2细胞增殖率降低，差异具有统计学意义（P＜0.05，表 1），HepG2细胞凋亡率增加，差异具有统计学意义（P＜0.05，表1、图 1）。

表1 两组HepG2细胞增殖和凋亡（±s）比较

表1 两组HepG2细胞增殖和凋亡（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05

孔数 细胞增殖（%） 细胞凋亡(%)对照组 3 96.4±9.7 8.1±1.4抑制剂 3 72.3±6.4① 9.7±0.8①

图1 两组HepG2凋亡率比较

2.2 两组HepG2细胞miR-363 mRNA比较 与对照组比较，HepG2细胞总RNA水平无显著变化（P＞0.05，表 2），而抑制剂处理组 HepG2细胞miR-363 mRNA相对水平显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05，表 2）。

表2 两组HepG2细胞m iR-363 m RNA水平（±s）比较

表2 两组HepG2细胞m iR-363 m RNA水平（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05

孔数 总RNA（ng/μl） miR-363对照组 3 35.1±5.7 1.0±0.1抑制剂 3 34.7±4.7 0.6±0.2①

2.3 两组HepG2细胞E2F3、Bax和Caspase-3蛋白水平比较 与对照组比较，抑制剂处理组HepG2细胞E2F3蛋白表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.05，表 3、图 2），Bax蛋白和 Caspase-3 蛋白表达增加，差异具有统计学意义（P＜0.05，表3、图2）。

表3 两组HepG2细胞E2F3、Bax和Caspase-3蛋白表达水平（±s）比较

表3 两组HepG2细胞E2F3、Bax和Caspase-3蛋白表达水平（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05

孔数 E2F3对照组 3 0.9±0.1抑制剂 3 0.6±0.1①Bax 0.4±0.0 0.6±0.1①Caspase-3 0.5±0.1 0.7±0.0①

图2 两组HepG2细胞E2F3、BAX和Caspase-3蛋白表达变化

3 讨论

HCC是常见的恶性肿瘤，其发病率在恶性肿瘤中排第五位。在我国，PLC位于恶性肿瘤病死率的第二位，严重威胁到人类健康[11]。PLC复发是造成肝癌患者预后差、生存时间短的主要原因。肿瘤的复发涉及多因素和多个过程，其中miRNA的发现为肿瘤的防治研究提供了新的思路。miRNA是一种非编码单链小分子RNA，能以碱基互补的形式结合到靶基因的非编码区，结合到靶基因的3’-UTR区域，降解或者阻遏靶基因的翻译和蛋白表达，从而对转录后基因进行负调控影响[12]。miRNA占人类基因数量的1%～3%，却调控着超过30%的基因表达[13]。约有50%肿瘤的变异区域内可检测到miRNA基因，且其结果具有可重复性，说明它们参与了多种细胞进程，如细胞增殖、分化、凋亡等，提示miRNA可能与肿瘤发生发展密切相关。在癌组织中，一些miRNA会特异地表达增高或降低，如 miRNA-155、miRNA-10b、miRNA-363和miRNA-21等常表达过度，而miRNA-214、miRNA-518b、miRNA-17p、miRNA-126、miRNA-335和 miRNA-205等则表达下调，从而促进肿瘤细胞的发生、发展、侵袭和转移[14]。因此，miRNA在肿瘤的诊断、治疗和预后评估等方面具有广阔的应用前景。

miRNA-363在多种肿瘤中表达异常，通过调控不同的靶基因，从而调节细胞增殖和凋亡。miRNA-363通过铆钉肝癌细胞Mcl-L区域而影响肝癌细胞的增殖[15]。在头颈部鳞状细胞癌细胞凋亡时，miRNA-363处于低表达状态。同时，miRNA-363的表达降低可减弱神经母细胞瘤细胞的侵袭和迁移能力[16]。E2F家族是最先在腺病毒E2基因中被发现，目前共发现了8个E2F成员。由于结构的差异，不同成员间功能也不尽相同[17]。E2F3参与细胞周期G1/S的调控和影响DNA的合成速度，与肝癌、乳腺癌和结肠癌等肿瘤的发生密切相关[18]。同时，E2F3还可以激活ARF基因，发挥原癌基因作用，对p53信号通路进行正调控，参与了细胞的增殖和凋亡。研究发现，E2F3在肝癌组织中高表达，使细胞周期在G1期停滞，促进了细胞凋亡[18]。Bax是Bcl-2家族中重要成员，Bax表达增加，使线粒体膜电位发生改变，使膜通道开放，将细胞色素C释放到细胞质中，诱导凋亡小体形成，从而激活Caspase家族。Caspase家族是细胞凋亡执行者。当Caspase被激活后，将引发Caspase级联反应，凋亡启动因子（Caspase-2、9等）发生活化并激活下游凋亡执行因子（Caspase-3、6、7等），尤其是 Caspase-3的激活，表示细胞凋亡进入了不可逆阶段，最终导致细胞进入凋亡阶段[19]。本研究发现，使用了miR-363抑制剂后，抑制剂处理组HepG2细胞miR-363 mRNA相对水平降低，进而调控E2F3的蛋白表达降低，使Bax和Caspase-3蛋白表达增加，抑制HepG2细胞增殖，并促进HepG2细胞凋亡。

综上所述，miR-363可靶向调控E2F3的表达，使E2F3的表达降低，从而引起Bax和Caspase-3级联化表达程序，抑制HepG2细胞增殖和诱导HepG2细胞凋亡，为 HCC的发生、发展机制和靶向治疗提供了一定的理论依据。