核磁共振法测定蛋黄中磷脂酰胆碱含量的实验研究

邓冬艳, 邓鹏翅, 宋红杰, 齐 悦

(1. 四川大学 化学学院, 四川 成都 610064; 2. 四川大学 分析测试中心, 四川 成都 610064)

卵磷脂是一种含磷的极性脂类物质,包括磷脂酰胆碱( PC) 、磷脂酰乙醇胺( PE) 、磷脂酸( PA) 和磷脂酰肌醇(PI)等,由法国人Gobley于1846—1847年从脑和蛋黄中首先发现[1]。

卵磷脂具有重要的营养保健功能,能够改善机体的神经功能、提高大脑活动、防止心血管疾病等,被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”。卵磷脂主要存在于大豆、菜籽、坚果、蛋黄及动物脑等物质中[2]。卵磷脂主要包括蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂。卵磷脂制备方法主要有:有机溶剂萃取法、柱层析法、乙酰化法、复合盐沉淀法以及超临界二氧化碳萃取法等[3]。目前, 对卵磷脂相关食品中磷脂酰胆碱含量的测定还没有国标方法, 国内外在这方面的报道较少, 如采用薄层扫描、高效液相色谱法(HPLC)、分光光度法等,这些方法存在操作繁琐、分析时间长、干扰大、分离不好等缺点,检测效果不够理想。因此,寻找更加简单、方便的分析方法具有很高的应用价值[4]。

核磁共振技术定性定量分析法逐渐得到重视[5-7]。虽然该方法测定误差比HPLC大,但其仍然存在显著优势,包括需要的样品量很少、扫描时间短、不需要标准品,而且样品不需要预处理,测定过程非常方便。近年来,有诸多文献报道利用核磁共振法进行化合物的含量测定[8-11]。全志利等以苯甲醇为内标物,利用核磁共振氢谱测定天然气中硫化氢含量；吴迪等利用19F 谱核磁共振技术建立吉非替尼含量的测定方法,为含氟药物快速准确的含量测定方法建立奠定了基础。

本文旨在探索利用核磁共振技术建立PC的定性定量分析方法。工作中以新鲜蛋液为原料,以PC为研究对象,在以往卵磷脂提取方法的基础上,采用乙醇(萃取)-丙酮(脱脂、重结晶)联合提取法提取、纯化蛋黄卵磷脂。

1 实验

1.1 主要试剂、材料与仪器

试剂与材料:本实验中所用全部试剂均为分析纯及以上。电阻率为18 MΩ·cm的去离子水由纯水系统(成都超纯科技有限公司)制得；市售鲜鸡蛋、鲜鸭蛋及鲜鹌鹑蛋；无水乙醇、丙酮购自成都科龙试剂有限公司；氘代氯仿购自青岛腾龙微波科技有限公司；磷脂酰胆碱(PC,纯度>99%)、磷酸三苯脂(TPP,纯度≥99.8%)购于阿拉丁试剂公司。

仪器:核磁共振仪(AVANCE III HD, 400 MHz, Bruker, Germany)；高速离心机(H-1850,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；旋转蒸发器(R-201,上海申顺生物科技有限公司)。

1.2 蛋黄卵磷脂的提取

称取一定量新鲜鸡蛋黄、鸭蛋黄和鹌鹑蛋黄分别置于玻璃烧杯中,按蛋质量与乙醇的体积比为1∶10,分别加入体积分数为95%的乙醇,常温磁力搅拌60 min,8 000 r/min离心10 min,取上清液；沉淀再加入95%的乙醇浸提、离心,合并2次上清液；置旋转蒸发仪中减压浓缩至近干,取出浓缩物,先用少量无水乙醇溶解然后加入丙酮重结晶纯化,分离沉淀,真空干燥,得到淡黄色蜡状卵磷脂,称重。按如下公式(1)计算提取率：

提取率=(卵磷脂质量/蛋黄质量)×100%

(1)

1.3 样品制备

1.3.1 内标物溶液的配制

称取磷酸三苯酯25.0 mg,加入1.0 mL 氘代氯仿、配成25.0 g/L的储备液待用。

1.3.2 PC标准溶液的配制

称取PC标准品,加入氘代氯仿配制质量浓度为1.0、2.5、5.0、10.0、15.0 g/L溶液,分别加入内标物溶液0.1 mL,然后移至核磁管内。

1.3.3 样品溶液的配制

称取提纯的蛋黄卵磷脂样品加入氘代氯仿配成一定浓度的样品溶液并移至核磁管内。

1.4 检测方法

1.4.11H NMR测定

所谓典故，是指诗文中古代故事和有来历出处的词语。适当运用典故可以增加文学表现力，在有限的词语中展现更为丰富的内涵；可以增加韵味和情趣，使文章委婉含蓄，避免平直。

氢谱分析条件：测定温度为25 ℃,检测频率为400.13 MHz,谱宽为4 807.69 Hz,脉冲宽度为11.9 μs,采集时间6.82 s,延迟时间为2 s,采集次数为256次。

分别对配制好的PC标准溶液和提纯样品溶液进行核磁氢谱测定。设置参数后测1H NMR谱图。吸收峰准确定标,调整峰相位,使峰形左右对称,调整基线。对比磷脂酰胆碱标准品及提取样品的核磁谱图,分析鸡蛋、鸭蛋和鹌鹑蛋蛋黄卵磷脂样品的成分及纯度。

1.4.231P NMR测定

磷谱分析条件:测定温度为25 ℃,检测频率为161.97 MHz,谱宽为4 854.37 Hz,脉冲宽度为11.9 μs,采集时间为6.75 s,延迟时间为2 s,采集次数为200次。

分别对配制好的PC标准溶液和提纯样品溶液进行核磁磷谱测定。设置参数后测31P NMR谱图。吸收峰准确定标,调整峰相位,使峰形左右对称,调整基线。

1.4.3 标准曲线的绘制、样品PC含量及加标回收实验的测定

将配制好的质量浓度为1.0、2.5、5.0、10.0、15.0 g/L的PC系列标准溶液,分别加入0.100 mL 内标物溶液,进行31P NMR测定。对PC和内标物的特征峰的面积进行积分,分别标识为S1和S2。然后以样品积分面积与内标物的积分面积比S1/S2为纵坐标,以样品的浓度与内标物的浓度比C1/C2为横坐标,绘制标准曲线。

然后往配制好的样品溶液中加入0.100 mL 内标物溶液,同样进行31P NMR测定,对PC和内标物的特征峰的面积进行积分,将S1/S2值代入线性回归方程获得样品中PC浓度值。通过下式计算样品中PC含量w：

w=C1V/m1

(2)

式中,C1为计算得的PC浓度,V为样品体积,m1为称取被测样品的质量。

根据样品中测得PC含量分别加入一定量的PC标准品,然后测定31P NMR,对PC和内标物的特征峰的面积进行积分,根据线性回归方程计算样品回收率值。

2 结果与讨论

2.1 蛋黄卵磷脂提取率

传统的卵磷脂制备方法都采用有机溶剂提取,其原理是根据不同物质在同种溶剂中溶解度的不同而将卵磷脂与其他物质分离。由于溶剂萃取法所得卵磷脂产品杂质含量较高,因此,本工作采用乙醇(萃取)-丙酮(脱脂、重结晶)联合提取法提取、纯化蛋黄卵磷脂。将得到的固体真空干燥后称量,按公式(1)计算提取率。实验结果得到鸡蛋、鸭蛋及鹌鹑蛋的蛋黄卵磷脂提取率分别为4.88、5.35、8.14 mg/g。

2.2 PC标准品和提取物的核磁共振氢谱比对

测定PC标准品和几种鲜蛋蛋黄卵磷脂提纯物的1H NMR,结果如图1所示。结果表明,PC标准品的质子峰主要出现在化学位移δ=3.2 ～ 5.4 ppm之间,3种鲜蛋蛋黄卵磷脂提纯物的质子峰也出现在该区域,且谱峰基本一致。可知,采用该乙醇(萃取)-丙酮(脱脂、重结晶)联合提取法所得蛋黄卵磷脂成份纯度较高。

图1 PC标准品和几种蛋黄卵磷脂提纯物在氘代氯仿中的1H NMR谱图

2.3 内标物和溶剂的选择

磷脂类化合物不溶于水,易溶于氯仿、甲醇等溶剂。拟选择的内标物磷酸三苯酯不与分析物发生反应,且能与醇、氯仿、苯等混溶,而且氘代氯仿经济实惠,因此选择氘代氯仿作为溶剂。内标物的化学结构及其31P NMR谱见图2。

图2 磷酸三苯酯在氘代氯仿中的31PNMR谱图

由图2可知,磷酸三苯酯分子只含有1个磷原子,因此只在δ=-17.71 ppm处出现1个尖锐的单峰,易于辨认,且此峰不会干扰待测样品峰,能够与样品峰很好分离(见图3)。此外，氘代氯仿不含磷,亦不会干扰内标物的谱峰。同时磷酸三苯酯具有价格低廉的优点,可选作内标物。

图3 PC与磷酸三苯酯在氘代氯仿中的31PNMR谱

2.4 定量峰的选择

从图3可以看出,内标物的特征峰与被测物的特征峰完全分离,对不同的物质峰进行归属,在化学位移δ=-0.99 ppm和δ=-17.71 ppm出现2个较大的尖锐峰,且无其他杂峰干扰。δ=17.71 ppm处信号为磷酸三苯酯的物质峰,则δ=-0.99 ppm处为PC峰,峰形尖锐,易于积分定量分析,故选作定量峰。

2.5 标准曲线的测定

取质量浓度为1.0、2.5、5.0、10.0、15.0 g/L的PC系列标准溶液,分别加入0.100 mL内标物溶液,进行31P NMR测定。对PC和内标物的特征峰的面积进行积分,分别标识为S1和S2，绘制的标准曲线如图4所示。

图4 核磁共振磷谱测定PC的积分面积与浓度线性关系

图4显示,在PC质量浓度为1.0～15.0 g/L的范围内,S1/S2与C1/C2呈现良好的线性关系,回归方程为y=0.653x-0.115,相关系数R2=0.991。表明以磷酸三苯酯为内标物,采用核磁共振磷谱法测定磷脂酰胆碱的含量是可行的。

2.6 样品中磷脂酰胆碱含量以及加标回收测定

取配制好的样品溶液,加入0.100 mL内标物溶液,进行31P NMR测定,得到的谱图如图5所示。可以看出,物质峰与内标物的峰能够完全分离,根据前面所述,δ=-0.99 ppm处信号为PC峰。同时从图5可知,除PC峰外,其附近还出现一小的杂质峰,可能为其他磷脂类化合物,如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇等[12]。

图5 蛋黄样品中提纯PC与磷酸三苯酯在氘代氯仿中的31P-NMR谱

对PC和内标物的特征峰面积进行积分,将S1/S2值代入线性回归方程获得样品中PC的浓度值。通过公式(2)计算样品中PC含量,结果如表1所示。同时进行加标回收实验,表1中测定结果表明,此方法测定的PC含量的回收率在92% ～ 105% 之间,因此使用核磁共振磷谱内标法测定蛋黄中PC 含量有较好的准确度。

表1 几种鲜蛋蛋黄样品的PC 质量以及百分含量测定结果

3 结语

本文以新鲜蛋液为原料,以磷脂酰胆碱为研究对象,采用乙醇(萃取)-丙酮(脱脂、重结晶)联合提取法提取、纯化蛋黄卵磷脂；利用核磁共振技术,以磷酸三苯酯为内标物,以化学位移δ=-0.99 ppm和δ=-17.71 ppm处的磷脂酰胆碱和磷酸三苯酯的单峰作为定量峰,得到其峰面积比与其浓度比线性回归方程为y=0.653x-0.115,相关系数为R2=0.991,由此建立磷脂酰胆碱的核磁共振定性定量分析方法。采用料液比为1∶10、乙醇浓度为95%、提取时间为60 min的提取条件,不同种类蛋黄中卵磷脂提取量为4.88～8.14 mg/g；所研究的几种蛋类其蛋黄中磷脂酰胆碱百分为16.9～27.4%,加标回收实验结果令人满意,成功将核磁共振技术用于蛋黄中磷脂酰胆碱的分析测定。