孔雀草体内低分子质量巯基化合物对重金属镉的响应

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(贵州大学生命科学学院， 贵阳 550025)

随着生活和工业废弃物的长期排放、磷肥大量施用、矿产开采等人类活动导致环境中的镉污染日趋严重。镉由于其在水中溶解度大、毒性较高，并且在土壤污染中具有隐蔽性和滞后性等特点，因此是环境中最具危害性的重金属之一[1-3]。研究表明，镉对多种植物的代谢过程有毒性作用，例如光合作用、呼吸、氮代谢、蒸腾作用、养分吸收等[4-5]，越来越多的证据表明镉会引起植物的氧化应激反应，改变膜的功能性，还会引起细胞器结构和超微结构损伤，高浓度镉还会引起DNA损伤，干扰植物的生长和发育[6-9]，镉还会通过食物链危害人类健康。因此，如何解决重金属污染问题，将对人类健康和社会发展起着巨大的促进作用。植物修复技术是一项新兴的环境污染治理技术，将花卉植物应用于重金属污染土壤的修复，不仅能治理污染土壤，还能美化环境，产生一定的的经济效益[10]，这在污染土壤修复的实际应用中已成为热点研究内容。

植物能以各种不同方式对重金属毒性做出响应，包括金属离子固定、排出、螯合和区室化，以及更普遍的胁迫响应机制如乙烯和应激蛋白的表达等[5]。有研究表明，植物细胞内含半胱氨酸残基的巯基化合物与重金属有较强的作用力[11]，其中半胱氨酸(Cys)是最重要的非蛋白巯基，他是合成谷胱甘肽的前体分子，在植物胁迫响应中起重要作用，谷胱甘肽(GSH)是细胞中游离的、低分子量硫醇库的主要组分，同时也是植物螯合肽(PCs)合成前体，主要以还原形式存在于细胞中，其大部分功能与谷胱甘肽的巯基及其作为还原剂有关，他在植株抗氧化过程中能被氧化成GSSG，高GSH/GSSG值是实现细胞中蛋白质正确合成的必要条件[12-13]，植物螯合肽由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，基本结构(γ-Glu-Cys)n-Glu(n=2-11)，能与重金属离子结合形成螯合物，这些复合物能被ABC-转运蛋白转移至液泡，达到解毒作用[14]。

孔雀草(TagetespatulaL.)是菊科万寿菊属一年生草本花卉，是镉超富集植物，关于镉胁迫对孔雀草低分子质量巯基蛋白含量的影响却未见报道。通过研究不同浓度镉胁迫对孔雀草不同组织低分子质量巯基蛋白含量的影响及相互关系，为进一步研究孔雀草镉胁迫耐受机制及对污染土壤的修复工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

孔雀草(TagetespatulaL.)种子采自贵州大学植物标本园当年结实的健壮植株，供试土壤为营养有机土，属于清洁土壤，不含金属物质。

准确称取1.0 kg营养有机土装入直径为21 cm，高12 cm的盆中，将固体CdCl2·2.5 H2O投加到土壤中，配成所需镉浓度为100，300，500 mg/kg的土壤，每日搅动，以使镉在土壤中充分混合均匀。

选取健壮饱满的孔雀草种子用75%乙醇消毒3 min。蒸馏水冲洗数次浸种12 h，播种10粒种子于不同浓度镉污染盆中，每个处理4个重复，每个重复保苗4株，以蒸馏水处理作为对照组，种植约90 d后，分离根、茎、叶用于巯基化合物含量测定。

1.2 分析测定项目

测定部位：成熟期孔雀草根、茎、叶。

测定指标：叶谷胱甘肽(GSH、GSSG)、半胱氨酸(Cys)、非蛋白巯基(NPT)。

试剂盒购于苏州科铭。

采用差减法计算植物组织内植物螯合肽(PCs)的含量，即PCs=NPT-GSH。

1.3 数据分析

实验数据采用Excel 2010软件和Graphpad Prism 5软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度Cd处理下孔雀草根、茎、叶NPT含量的变化

不同处理下孔雀草根、茎、叶的NPT含量变化如图1所示。由图1可以看出，根、叶中NPT的含量随着镉浓度的增加呈先升高后下降的趋势，茎中的NPT含量随着镉浓度增加而下降。随着镉浓度的升高，根中NPT含量比对照增加了13.25%(100 mg/kg)、15.06%(300 mg/kg)；叶中的NPT含量比对照增加了3.72%(100 mg/kg)、62.98%(300 mg/kg)、20.38%(500 mg/kg)，茎中的NPT含量比对照增加29.48%(100 mg/kg)、4.05%(300 mg/kg)，但高镉(500 mg/kg)处理时降低了根和茎中NPT的含量。

图1 不同浓度Cd处理对孔雀草根、茎、叶NPT含量的影响

2.2 不同浓度Cd处理下孔雀草根、茎、叶Cys含量的变化

不同处理下孔雀草根、茎、叶Cys含量变化如图2所示，根中的Cys含量随镉浓度增加呈先降低后升高趋势，在镉浓度为100，300 mg/kg时比对照下降了11.94%、38.81%，在镉浓度为500 mg/kg时比对照增加了35.82%；茎中的Cys含量随镉浓度增加呈先升高后降低趋势，同对照相比，在镉浓度为100 mg/kg时增加了102.50%，在镉浓度为300，500 mg/kg时下降了65%、75.71%，叶中的Cys含量随镉浓度增加呈先降低后升高再降低趋势，同对照相比，在镉浓度为100，500 mg/kg时下降了32.32%、58.84%，在镉浓度为300 mg/kg时增加了5.18% 。

图2 不同浓度Cd处理对孔雀草根、茎、叶Cys含量的影响

2.3 不同浓度Cd处理下孔雀草根、茎、叶GSH、GSSG、GSH/GSSG含量的变化

不同处理下孔雀草根、茎、叶GSH含量变化如图3 A所示，同对照相比，Cd增加了根中的GSH含量，其含量比对照增加1.54%(100 mg/kg)、17.90%(300 mg/kg)、50.93%(500 mg/kg)；低镉(100 mg/kg)时增加了茎中的GSH含量，随镉浓度增加，GSH含量呈下降趋势；叶中的GSH含量随镉浓度增加呈先下降后上升趋势，其含量比对照降低12.81%、24.07%、21.60%。

图3 B显示：不同Cd处理使根中的GSSG显著高于对照，在500 mg/kg 浓度时根中的GSSG含量比对照增加了49.67%，茎中的GSSG含量在低镉(100 mg/kg)时比对照降低了50%，而高镉(500 mg/kg)增加了茎中GSSG含量，叶中的GSSG含量随镉浓度增加呈先上升后下降趋势，其含量比对照增加了19.72%(100 mg/kg)、32.39%(300 mg/kg)、在镉浓度为500 mg/kg时比对照降低了11.27%。

图3 C为Cd对根、茎、叶GSH/GSSG值的影响，根和叶中的GSH/GSSG值为100，300 mg/kg时比对照低，但在高镉(300 mg/kg)时提高了根和叶GSH/GSSG值，低镉(100 mg/kg)处理提高了茎中的GSH/GSSG值，在300，500 mg/kg时降低了茎中GSH/GSSG值。

图3 不同浓度Cd处理对孔雀草根、茎、叶GSH、GSSG及GSH/GSSG含量的影响

2.4 不同浓度Cd处理下孔雀草根、茎、叶PCs含量的变化

不同处理下孔雀草根、茎、叶PCs含量变化如图4所示，根、茎、叶中PCs含量随镉浓度升高呈先增加后降低趋势，根比对照增加了14.41%(100 mg/kg)、14.78%(300 mg/kg)，茎比对照增加了33.72%(100 mg/kg)、6.67%(300 mg/kg)，叶比对照增加了7.44%(100 mg/kg)、82.60%(300 mg/kg)、29.84%(500 mg/kg)，在镉浓度为500 mg/kg时，根、茎PCs含量比对照分别下降了5.02%、4.67%。

图4 不同浓度Cd处理对孔雀草根、茎、叶PCs含量的影响

3 讨 论

找到具有某种重金属超积累特性的植株是植物修复的前提条件。目前，世界上大约有400多种、涵盖20多个科的植物属于重金属超积累植物[15]。孔雀草是镉超富集植物，观察镉胁迫下孔雀草生长状况可知，即使在500 mg/kg镉浓度胁迫下，孔雀草植株也未出现明显毒害症状。巯基物质在镉的积累和运输过程中起着重要作用，同时也是植物耐受重金属胁迫及解毒的重要机制之一[16]。

由于镉对-SH有很强的亲和力，能够诱导低分子质量巯基化合物GSH、PC等与镉形成Cd-GSH、Cd-PC复合体，减少胞质中游离的镉，并以Cd-SH形式运输到液泡中进行区隔化[17]。本实验结果表明，Cd处理能够诱导孔雀草根、茎、叶NPTs的产生，其中，叶中的NPTs含量随介质中镉浓度增加而增加，低中剂量Cd诱导根茎中的NPTs含量增加，而高Cd降低了根茎中的NPTs含量。杨卫东等研究表明，Cd处理强烈诱导旱柳(SalixmatsudanaKoidz.)根和叶NPTs产生，随镉浓度增加根和叶NPTs含量也随之增加[18]；不同浓度Cd处理提高了印度芥菜(Brassicajuncea)叶片中NPTs含量[19]，马齿苋(PortulacaoleraceaL.)根和叶中NPTs含量随Cd浓度和处理时间增加呈先上升后下降趋势[20]。有研究表明，NPTs含量的增加促进了Cys、GSH和PCs等低分子质量巯基化合物的合成，这些物质通过金属硫醇盐形式参与重金属解毒和稳态过程[21]。

Cys是硫酸盐同化的初始产物，是谷胱甘肽合成的限速因子，Cys合成可能参与植物体对Cd的解毒过程[22]。本研究结果表明，不同Cd浓度对根Cys含量影响不大，高浓度Cd只是轻微增加根Cys含量，低浓度Cd促进茎Cys合成，中高浓度Cd降低了茎Cys含量，叶中的Cys含量随镉浓度增加呈先下降后升高再下降趋势。文献报道，在拟南芥(Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.)叶子毛状体中，增加半胱氨酸物质含量可增强拟南芥对金属的螯合能力[13]。当印度芥菜超表达大肠杆菌(Escherichiacoli)编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)的gsh1基因，与对照相比，γ-ECS转基因植株表现出对Cd的耐受性增强并且具有更高浓度的PCs，γ-GluCys，谷胱甘肽和总非蛋白巯基含量[23]。

GSH能保护蛋白免受胁迫下蛋白质巯基氧化引起的变性，他还是谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的底物，共同参与植物体活性氧(ROS)的去除[24]。本研究发现，随介质中Cd浓度增加，根GSH、GSSG含量也随之增加，低中Cd浓度诱导叶GSH含量下降，GSSG含量升高，高Cd浓度GSH含量升高而GSSG含量下降，不同浓度Cd对茎GSH、GSSG含量影响较小， 根中GSH/GSSG值较高，茎次之，叶最小。有文献报道，Cd2+能引起美人蕉根GSH含量增加，并诱导PCs产生[25]，重金属处理促进秋茄(Kandeliacandel(Linn.) Druce)幼苗GSH合成，为PCs合成提供前提物质[26]。GSH与其氧化形式GSSG一起，作为维持细胞稳态的重要氧化还原对，在植物不同信号系统中发挥着关键作用[27]，但谷胱甘肽作为普遍的胁迫标记物作用仍不清楚，因为谷胱甘肽反应本身就处于动态平衡当中。

PCs在植物对重金属Cd的抗性机制中起重要作用，该物质解毒作用与其重金属结合能力有关，其结构中的Cys巯基与Cd2+形成配位键，进而形成PCs-Cd复合物,由转运蛋白运输到液泡进行区隔化[28]，本研究发现， 孔雀草根、茎中PCs含量随镉浓度增加呈先上升后下降趋势，低中Cd浓度促进叶PCs合成，高Cd浓度降低了PCs的合成。冯倩等研究表明，万寿菊(TageteserectaL.)茎叶中PCs含量随镉浓度升高而增加，但在高Cd浓度处理下，茎叶PCs含量大幅下降[29]。除重金属Cd以外，其他重金属也能诱导植物合成PCs，但PCs对这些重金属离子是否有解毒作用尚不清楚，有文献报道，PCs并非都参与植物对重金属的耐受机制，如在Zn抗性植物欧洲丁香(SyringavulgarisL.)中，低分子量有机酸而非PCs参与了胞内Zn2+的结合[30]。

4 结 论

不同浓度镉胁迫能诱导孔雀草低分子质量巯基化合物的产生，适当Cd浓度处理提高了孔雀草根、茎、叶NPT、PCs物质的含量，影响Cys和GSH代谢，不同程度提高GSH/ GSSG值，说明低分子质量巯基物质参与孔雀草对Cd的耐性及解毒过程。