苦参碱调控结肠癌奥沙利铂耐药性及机制研究

王伟，郑兵，任锐，朱涛

（四川省宜宾市第一人民医院，普外科， 四川 宜宾 644000）

结肠癌是临床上常见的消化道疾病之一，临床上主要采用手术与化疗联合治疗，但患者的长期生存率较低，且有时不能完全治愈，甚至化疗药物的耐药性问题也随着出现，这是临床上结肠癌治疗失败的主要原因之一[1-2]，故研究结肠癌化疗耐药性尤为重要。研究显示[3-6]，肿瘤对化疗药物多药耐药是影响结肠癌化疗疗效的主要因素，耐药基因MDR1编码调控P-糖蛋白（glycoprotein, P-gp），结肠癌细胞高表达P-gp是影响治疗效果的主要障碍之一。众多研究表明[7-9]，JNK/SAPK信号通路与肿瘤细胞的化疗耐药性密切相关，本研究将探讨苦参碱（matrine, Ma）对人结肠癌耐奥沙利铂细胞株（SW480/Oxa）耐药性的影响及是否与JNK/SAPK信号通路有关。

1 材料与方法

1.1 材料

结肠癌SW480细胞购自购自中科院上海细胞库，环王巴明、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide, DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）均购自Sigma公司，RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自Gibco公司，Annexin-V-FITC/PI凋亡试剂盒购自南京生物建成研究所，P-gp、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化c-Jun氨基端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase, p-JNK）、c-Jun、 磷 酸 化 c-Jun（phosphorylated c-Jun, p-c-Jun）抗体购自Abcam公司，过氧化物酶增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPARγ）和JNK阻断剂 SP600125均购自美国R＆D Systems公司，Trizol试剂盒、逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒均购自日本TaKaRa公司，TGL-16G-A型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），7300型实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪（美国Applied Biosystems公司），基础电泳仪（美国Bio-Rad公司），酶标仪（Thermo公司），EL204-电子天平（上海特勒-托多利多仪器有限公司），凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司），电泳仪（北京六一仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 结肠癌SW480细胞，采用RPMI 1640培养液[添加10%FBS，1%双抗（链霉素100 u/ml，青霉素 100 u/ml）]，置于 5% 二氧化碳 CO2，37℃的培养箱条件下进行培养。

1.2.2 获得性Oxa耐药结肠癌SW480细胞的建立 按照文献[10]，首先，采用0.1 μmol/L的奥沙利铂（oxaliplatin, Oxa）处理SW480细胞，Oxa处理后大部分细胞死亡，少量细胞存活，待存活细胞继续生长到融合度达90%时，进行传代3代，之后提高浓度至0.5 μmol/L的Oxa处理SW480细胞，以此方法再提高到1.0 μmol/L的Oxa处理SW480细胞，最终获得临床血药浓度2.0 μmol/L，传代5代，稳定的耐药细胞SW480/Oxa细胞。

1.2.3 MTT法检测Ma给药浓度 为选择合适的Ma浓度进行后续实验，首先采用MTT法检测Ma对SW480/Oxa耐药细胞的IC50值。取对数生长期的细胞，以2×104个/孔接种于96孔培养板中，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h贴壁后，分组进行实验。加入终浓度分别为 0、1、5、10、20 及 30 μmol/L 的 Ma（含DMSO的终浓度为0.1%）；溶剂对照组调整DMSO的终浓度为0.1%；空白对照组不做任何处理。继续培养24 h。每孔加20 μl MTT，37℃孵育4 h，弃上清，再加入100 μl DMSO溶液，在酶标仪上测定570 nm波长各孔吸光度A值（A570）。细胞抑制率（IR）：IR（%）=（1-处理组平均A值/对照组平均A值）×100%。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期的SW480/Oxa细胞，以2×104个/孔接种于96孔培养板中，37℃、5% CO2培养箱中培养24 h贴壁后，分组与给药：①NC组：空白对照组（细胞不做任何处理）；②Oxa组：Oxa（2 μmol/L）；③Ma+Oxa组：Ma（10 μmol/L）+Oxa（2 μmol/L）。继续培养24 h。每孔加 20 μl MTT，37℃孵育4 h，弃上清，再加入100μl DMSO溶液，在酶标仪上测定570 nm波长各孔吸光度A值（A570）。每组设置3个复孔。细胞抑制率（IR）：IR（%）=（1-处理组平均A值/对照组平均A值）×100%。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 取对数生长期的细胞，以5×103个/ml接种于6孔板，每组设置3个复孔。用含10%胎牛血清的RPMl l640培养基培养在37℃、5% CO2培养箱中培养24 h至贴壁，实验分组与给药同1.2.4项下，根据Annexin-V-FITC/PI凋亡试剂盒说明书操作，流氏细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.6 qRT-PCR检 测P-gp、MDR1 mRNA表 达水平 参照文献[11]，检测P-gp、MDR1 mRNA。取对数生长期的细胞，以5×103个/ml浓度接种于6孔板，每组设置3个复孔。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养在37℃、5% CO2培养箱中培养24 h至贴壁，实验分组与给药：①NC组：空白对照组（细胞不做任何处理）；② Oxa组：Oxa（2 μmol/L）；③ Ma+Oxa 组 ：Ma（10 μmol/L）+Oxa（2 μmol/L）；④ PPARγ+Oxa组：PPARγ（0.1 μg/L）+Oxa（2 μmol/L）；⑤ SP600125+Oxa 组：SP600125（100 μg/L）+Oxa（2 μmol/L）；⑥ PPARγ+Ma+Oxa组：PPARγ（0.1 μg/L）+Ma（10 μmol/L）+Oxa（2 μmol/L）；⑦ SP600125+Ma+Oxa组：SP600125（100μg/L）+Ma（10 μmol/L）+Oxa（2 μmol/L）。根据 Trizol试剂盒提取组织总RNA，采用核酸测定仪测定RNA纯度和浓度，取1 μg进行逆转录，生成cDNA。采用SYBR green染料法进行定量检测，P-gp扩增引物序列为：P-gp，正向 5'-TACTCACGCCTCGAAACCT-3'，反向 5'-GTCTGCTTTCCTCCCTGATG-3'；MDR1，正向5'-CCC ATCATTGCAATAGCAGG-3'，反向5'-GTTCAAACTTC TGCTCCTGA。以GAPDH基因为内参，其引物序列如下：GAPDH，正向5'-CCTAGTTCGTCATGGGTG TGAACCA-3'，反向5'-GCCAGTAGAGGCAGGGATGA TGTTC-3'，扩增条件及计算方法参考文献[12]。

1.2.7 Western blot检测P-gp、p-JNK蛋白的表达水平 参照文献[13]。取对数生长期的细胞，以5×103个/ml浓度接种于6孔板，每组设置3个复孔。用含10%胎牛血清的RPMl 1640培养基培养在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h至贴壁，实验分组与给药同1.2.6项下。常规方法提取组织总蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）方法测定蛋白质含量后，进行凝胶电泳，每孔上样20 μg，电转至聚偏氟乙烯薄膜（polyvinylidene fluoride, PVDF）上后，3%的脱脂奶封闭2 h，分别孵育P-gp、p-JNK（目的蛋白）和β-actin（内参蛋白）一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜，孵育二抗后显影。采用Quantityone软件对条带亮度进行分析。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ma的给药浓度

Ma对SW480/Oxa细胞的IC50浓度为30 μmol/L。考虑到Ma与Oxa对癌细胞可能存在协同杀伤癌作用，并且为尽量减轻高浓度药物引发的毒副作用，选择IC50前一浓度作为Ma浓度进行后续实验，即选择20 μmol/L作为后续实验Ma的给药浓度。见图1。

图1 MTT法检测Ma给药浓度

2.2 细胞增殖活性情况

NC组、Oxa组和Ma+Oxa组细胞增殖活性分别为（99.67±2.12）、（72.12±1.12）和（61.34±1.15），差异有统计学意义（F=12.218，P=0.000）。进一步分析显示，Oxa组细胞增殖活性低于NC组，差异有统计学意义（P＜0.05）。而Ma+Oxa组细胞增殖活性低于Oxa组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 细胞凋亡情况

Oxa组与NC组细胞总凋亡率比较，采用t检验，差异有统计学意义（t=4.012，P=0.049），Oxa组细胞总凋亡率高于NC组。Ma+Oxa组与Oxa组细胞总凋亡率比较，采用t检验，差异有统计学意义（t=4.342，P=0.043），Ma+Oxa组细胞总凋亡率高于Oxa组。见图2。

2.4 Ma对SW480/Oxa细胞P-gp、MDR1 mRNA表达的影响

研究发现，在Ma+Oxa组、PPARγ+Oxa组及PPARγ+Ma+Oxa组 3组 间 的 P-gp mRNA（F=14.315，P=0.000）以及 MDR1 mRNA（F=16.267，P=0.000）的相对表达水平差异有统计学意义。见表1。在Ma+Oxa组、SP600125+Oxa组以及SP600125+Ma+Oxa组3组间的P-gp mRNA（F=13.213，P=0.000）以及 MDR1 mRNA（F=15.221，P=0.000）的相对表达水平差异有统计学意义。

图2 流式细胞仪检测细胞凋亡情况

表1 Ma对SW480/Oxa细胞P-gp、MDR1 mRNA表达的影响 （n =3，±s）

表1 Ma对SW480/Oxa细胞P-gp、MDR1 mRNA表达的影响 （n =3，±s）

注：1）与 Ma+Oxa组比较，P ＜0.05；2）与 PPARy+Ma+Oxa组比较，P ＜0.05；3）与 SP600125+Ma+Oxa组比较，P ＜0.05

组别 P-gp F值 P值 MDR1 F值 P值Ma+Oxa组 146.32±4.6 149.31±4.3 PPARγ+Oxa组 203.19±6.11）2） 14.315 0.000 210.45±5.81）2） 16.267 13.213 PPARγ+Ma+Oxa组 176.21±5.31） 172.54±4.91）Ma+Oxa组 146.32±4.6 149.31±4.3 SP600125+Oxa 组 134.21±3.41）3） 13.213 0.000 140.15±3.81）3） 15.221 13.213 SP600125+Ma+Oxa组 123.16±2.31） 131.15±3.11）

2.5 P-gp、p-JNK蛋白的表达水平

研究发现，在Ma+Oxa组、PPARγ+Oxa组以及PPARγ+Ma+Oxa组3组间的P-gp蛋白（F=12.315，P=0.000）以及p-JNK蛋白（F=15.267，P=0.000）的相对表达水平差异有统计学意义。见图3和表2。在Ma+Oxa组、SP600125+Oxa组以及SP600125+Ma+Oxa组3组间的P-gp蛋白（F=13.213，P=0.000）以及p-JNK蛋白（F=15.221，P=0.000）的相对表达水平差异有统计学意义。见图3和表2。

表2 Western blot检测P-gp，p-JNK蛋白的相对表达水平 （n =3，±s）

表2 Western blot检测P-gp，p-JNK蛋白的相对表达水平 （n =3，±s）

注：1）与Ma+Oxa组比较，P ＜0.05；2）与PPARγ+Ma+Oxa组比较，P ＜0.05；3）与SP600125+Ma+Oxa组比较，P ＜0.05

组别 P-gp F值 P值 p-JNK F值 P值Ma+Oxa组 0.489±0.052 0.221±0.031 PPARγ+Oxa组 0.867±0.0771）2） 12.315 0.000 0.434±0.0421）2） 15.267 0.000 PPARγ+Ma+Oxa组 0.576±0.0561） 0.284±0.0331）Ma+Oxa组 0.489±0.052 0.221±0.031 SP600125+Oxa组 0.369±0.0271）2） 13.213 0.000 0.246±0.0191）2） 15.221 0.000 SP600125+Ma+Oxa组 0.298±0.0241） 0.135±0.0131）

图3 Western blot检测P-gp，p-JNK蛋白的相对表达

3 讨论

中药苦参为豆科多年生落叶灌木植物苦参的干燥根。苦参性苦、寒，具清热燥湿、杀虫、利尿等功效，用于热痢、便血、黃疸尿闭、赤白带下、湿疹等。苦参碱是苦参中的抗癌有效成分，对肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和直肠癌等细胞均具有生长抑制作用。奥沙利铂能够通过作用于DNA形成链内和链间交联来抑制DNA的合成，产生抗肿瘤活性以及细胞毒作用[14]。由于因个体基因遗传差异，结肠癌患者对于奥沙利铂化疗敏感性存在较大的差异，其中产生奥沙利铂的耐药性是导致患者化疗失败的主要原因。肿瘤细胞多药耐药（multi drug resistance, MDR）机制复杂，如MDR基因过多表达、DNA拓扑异构酶Ⅱ活性降低或含量减少、谷胱甘肽解毒酶系统活性增高、MDR相关蛋白基因表达增高等。其中P-gp和LRP介导的MDR研究较多，是机制最为明确的MDR产生途径。P-gp和LRP在细胞的表达水平与细胞耐药程度呈正相关。最近已经有多项研究表明苦参碱能够抑制结肠癌细胞的生长。FOFARIA[15]研究发现，2.0 mg/ml苦参碱能够抑制结肠癌细胞HT-29的生长并且能够抑制 COX-2的表达；NIU等[16]也观察苦参碱能够抑制结肠癌细胞SW116的增殖，并且抑制细胞端粒酶的活性；CHANG等[17]进一步深入研究发现苦参碱通过上调Bax的表达以及下调Bcl-2的表达来诱导HT-29细胞的调亡，从而起到抑制结肠癌细胞HT-29增殖的作用。众多研究表明[18-20]，JNK/SAPK信号通路与肿瘤细胞的化疗耐药性密切相关，本研究为了尽量减轻高浓度药物引发的毒副作用，笔者选择IC50前一浓度作为Ma浓度进行后续实验，即选择10 μmol/L作为后续实验Ma的给药浓度。结果发现，Ma可抑制其增值，促进其凋亡，Ma可降低P-gp，MDR1 mRNA表达，还可降低P-gp、p-JNK蛋白的表达，提示Ma具有调控人结肠癌耐药细胞株耐药性的作用，可能与抑制JNK/SAPK信号通路，降低P-pg表达有关。本研究结果提示，Ma对调控结肠癌化疗耐药性有一定效果，研究结果为应用苦参碱干预结肠癌机制提供实验依据，Ma有望成为改善结肠癌化疗耐药性的新药物，但还需大量的基础实验和临床实验深入研究。

综上所述，Ma具有调控人结肠癌耐药细胞株耐药性的作用，可能与抑制JNK/SAPK信号通路，降低P-pg表达有关。