嘌呤P2X7受体介导对氯苯丙酸致大鼠前额皮质蛋白激酶的变化*

王慧，曹敏玲，左文彪，史琴

（贵阳中医学院 1.功能实验室，2.生理教研室，贵州 贵阳 550025）

脑内5-羟色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）对睡眠和觉醒功能具有重要的调节作用，但5-HT浓度改变后通过何种途径引起大脑皮质兴奋性变化尚未明确。研究表明，三磷酸腺苷（ATP）及其嘌呤P2X受体在睡眠活动的稳态调控中起到重要的作用[1-3]，细胞内ATP逐渐升高与非快速动眼睡眠delta波活动相一致[4]；P2X受体激动剂增加NREM睡眠而P2X受体拮抗剂则抑制大鼠NREM睡眠；P2X7受体的蛋白表达水平能随着睡眠周期的改变而改变[5]。前期研究发现对氯苯丙氨酸（parachlorophenylalanine, PCPA）所致的脑内5-HT浓度下降能引起大鼠前额皮质ATP含量下降，Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶的活性下降[6]，本研究进一步探讨中枢5-HT与P2X受体及受体后信号蛋白激酶的作用关系，探讨促眠药物可能的作用环节和靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 清洁级SD雄性大鼠36只。体重200～220 g（湖北省实验动物研究中心，合格证号42000600010950），置于安静、温度保持恒定（22±2）℃、避免强光的环境中饲养7 d。

1.1.2 试剂与药物 PCPA、OxATP（非选择性P2X受体拮抗剂）、A438079（高选择性P2X7受体拮抗剂）和BzATP（P2X7受体激动剂）（购自美国Sigma公司），CaMKII和 PKC（美国 Abcam 公司）、P38 MAPK（CST）、二步法免疫组织化学（简称免疫组化）试剂盒（北京中杉金桥公司），DAB显色剂（北京索莱宝科技有限公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），cDNA合成试剂盒（Gene Copoeia），荧光定量试剂盒（大连宝生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组及处理 大鼠随机分为6组（每组6只）：正常组、对照组、PCPA组[300 mg/（kg·d），腹腔注射，连续3 d]、OxATP、BzATP及A438079干预组，除正常组外，动物用10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，固定于立体定位仪上，根据Paxinos and Watson立体定位图谱定位脑室位置（前囟后0.8 mm，中线外1.5 mm，颅骨表面下4.5 mm），在颅骨上钻一小孔，将单管微量给药系统导管插入左侧脑室位置，用牙托粉和牙托水固定，腹腔注射青霉素抗感染3 d，手术 7 d 后用于实验。OxATP（4 nmol，5 μl，）、BzATP（4 nmol，5 μl）及 A438079（10 μmol，5 μl）均为脑室给药，每天1次，连续3 d。末次给药2 h后取大脑皮质前额叶组织，分为左右2个部分，分别保存于-80℃冰箱及存放于10%多聚甲醛中备用。

1.2.2 免疫组织化学染色及分析 将前额皮质用石蜡包埋。免疫组化采用非生物素二步法，按试剂盒说明书操作。每只大鼠选取3张400倍照片，使用IPP 6.0软件对免疫组化照片进行光密度分析，检测PKC、CaMKⅡ和P38 MAPK阳性细胞的平均光密度值（MD）。

1.2.3 Western blot检测PKC、CaMKⅡ和P38 MAPK蛋白表达 将100 g组织块置于匀浆器中加入1 ml蛋白裂解液，在冰上进行匀浆，裂解30 min后，将裂解液移至1.5 ml离心管中，4℃下12 000 r/min离心5 min，取上清置于-20℃冰箱冷冻保存。对样品进行蛋白浓度检测，根据标准蛋白浓度和相应的吸光值计算直线回归方程，利用回归方程计算出样品蛋白浓度。将提取的蛋白上清与5倍蛋白上样缓冲液混合，放入沸水10 min变性。配制电泳胶和浓缩胶，上样（上样量为40 μg）、电泳分离（浓缩胶80 V，分离胶120 V）。使用PVDF膜进行转膜，转膜条件：GAPDH及P38 MAPK：200 mA，90 min；CaMK Ⅱ：200 mA，120 min；PKC：250 mA，120 min。进行免疫印迹显色，用含5% 脱脂奶粉的TBST封闭液浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h，再用封闭液稀释相应的一抗（GAPDH、P38 MAPK和PKC稀释比为1∶1 000，CaMK Ⅱ稀释比为1∶2 000），使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜，TBST漂洗膜5次，将PVDF膜浸泡于已用封闭液稀释的二抗孵育液中，37℃摇床孵育2 h。TBST充分洗涤PVDF膜5次，ECL显影，用Band Scan分析胶片灰度值。将目标蛋白的灰度值与内参蛋白（GAPDH）比值作为目标蛋白的相对表达量。

1.2.4 实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测PKC、CaMKⅡ和P38 MAPK mRNA表达 ①取-80℃冰箱中保存的新鲜冷冻的组织100 mg，Trizol法提取RNA，紫外分光光度计测定A260/A280比值，比值在1.8～2.0之间满足实验要求。将总RNA放于-80℃冰箱内保存以备用。②逆转录：将RNA加入逆转录反应体系（按试剂盒说明书操作），逆转录为cDNA。引物为北京擎科生物公司合成。引物序列见表1。③半定量RT-PCR检测反应体系为：内参正向引物（10 μmol/L）0.5 μl，内参反向引物（10 μmol/L）0.5 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，ExTaq 0.25 μl，10×ExTaq E buffer 2.5 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 加至 25 μl。反应条件为 ：94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸25 s。PCR产物电泳分析，琼脂糖凝胶电泳显示扩增的目的基因片段大小与设计的目的基因片段大小一致（见图1）。④qRTPCR检测反应体系为cDNA（10倍稀释）4 μl，正向引物（100 μmol/L）0.4 μl，反向引物（100 μmol/L）0.4 μl，SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix （2×）10 μl，纯水5.2 μl。反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性30 s；60℃退火与延伸30 s；40个循环。获得P38 MAPK mRNA、PKC mRNA、CaMKⅡ mRNA及GAPDH的Ct值，以目的基因相对于基础值的表达量2-△△Ct反映各检测指标的表达水平。

表1 实时定量PCR引物序列

图1 各组大鼠前额皮质组织P38 MAPK、PKC和CaMK Ⅱ电泳图

1.3 统计学方法

数据分析采用SSPS 16.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），在方差分析有意义的基础上，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠大脑皮质P38 MAPK、PKC和CaMK Ⅱ蛋白和mRNA的表达

与对照组 [P38 MAPK（0.190±0.016），PKC（0.472±0.054），CaMK Ⅱ（0.396±0.061）]比较，PCPA 组 P38 MAPK蛋白表达增加（0.370±0.054）（t=7.838，P=0.000），而 PKC（0.258±0.025）（t=-8.881，P=0.000）和 CaMK Ⅱ（0.210±0.054）（t=-5.562，P=0.000）的蛋白表达水平下降（见图2～5）。PCPA组的P38 MAPK mRNA表达增加，而PKC和CaMK mRNA表达水平下降（均P=0.000）。见表2。

2.2 P2X7受体在PCPA引起的受体后蛋白激酶蛋白表达变化中的作用

与 PCPA 组 [P38 MAPK（0.370±0.054），PKC（0.258±0.025），CaMK Ⅱ（0.210±0.054）]比 较，PCPA+OxATP组及PCPA+A438079组P38 MAPK蛋白 表 达 水 平 下 降 [（0.284±0.038）（0.276±0.035）（t=3.185和3.591，P=0.009和0.004）]，但BzATP组P38 MAPK蛋白表达水平升高（0.452±0.046）（t=-2.854，P=0.017）。 与 PCPA 组 比 较，PCPA+OxATP组及PCPA+A438079组PKC蛋白表达水平[（0.344±0.034）（0.376±0.026）（t=-4.963 和 -8.209，均P=0.000）]和CaMKⅡ蛋白表达水平上升[（0.308±0.052）（0.293±0.048）（t=-2.620和-2.281，P=0.009 和 0.018）]，而 PCPA+BzATP 组 PKC（0.167±0.019）（t=7.098，P=0.000）和 CaMK Ⅱ（0.112±0.024）（t=4.454，P=0.002）蛋白表达水平下降。见图2～5。

图2 各组大鼠大脑皮质P38MAPK蛋白的表达 （免疫组化，×400）

图3 各组大鼠大脑皮质PKC蛋白的表达 （免疫组化，×400）

图4 各组大鼠大脑皮质CaMKⅡ蛋白的表达 （免疫组化，×400）

2.3 P2X7受体在PCPA引起的受体后蛋白激酶mRNA表达改变中的作用

PCPA+OxATP组和A438079组P38 MAPK mRNA表达水平下降，BzATP组P38 MAPK mRNA表达水平上升。OxATP及A438079能引起PKC和CaMKⅡ mRNA表达水平上升，但BzATP引起PKC及CaMKⅡ mRNA表达水平下降。见表2。

图5 各组大鼠皮质P38 MAPK、PKC及CaMKⅡ蛋白的相对表达量

3 讨论

睡眠障碍在临床上十分常见，已经成为影响人们健康生活和工作的重要社会问题。众所周知，5-HT是调节睡眠和觉醒重要的神经递质，但5-HT是如何与脑内其他调节系统相互作用从而调节睡眠活动目前还不清楚。本实验前期研究发现，脑内5-HT含量下降可导致神经胶质细胞激活，大脑皮质ATP含量下降，本研究发现，脑内5-HT含量下降能导致前额皮质细胞内蛋白激酶P38 MAPK蛋白及基因mRNA表达增加，PKC和CaMK Ⅱ蛋白及基因mRNA表达水平下降；进一步使用P2X7受体的激动剂和拮抗剂发现P2X7受体参与5-HT含量下降而导致的该细胞内信号蛋白激酶活动变化。

表2 各组大鼠大脑皮质P38 MAPK、PKC及CaMKⅡmRNA相对表达量 （n =6）

嘌呤P2X受体是一类以ATP为配体的离子门控通道，目前已知P2X受体分为8种亚型，即P2X、P2Y、P2T、P2S、P2N、P2U、P2Z和P2D，各种亚型的P2受体可以通过激活不同的细胞内信号转导通路而执行特定的生理功能。研究发现，P2X7受体与睡眠和觉醒有密切的关系，P2X7受体蛋白水平能随着睡眠周期的改变而改变[5]。在中枢神经系统内，P2X7R受体广泛分布于神经元和神经胶质细胞上[7]，P2X7受体兴奋能引起Ca2+的内流，激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）、蛋白激酶 C（protein kinase C, PKC）和钙调蛋白（CaM），改变P38 MAPK、PKC及CaMK等激酶的活性，引起一系列的细胞内反应[8-9]。研究表明，细胞外液的ATP可作用于神经胶质细胞上的P2X7R引起睡眠的调节物质细胞因子如白细胞介素 1（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）的释放，该物质作用于邻近的神经元，改变突触后神经元的敏感性[10-13]。

PCPA选择性抑制色氨酸羟化酶活性而抑制5-HT合成，导致脑内5-HT含量下降，实验证实，腹腔注射PCPA能导致大鼠大脑皮质5-HT浓度下降约80%[14]。新近的研究发现，5-HT3受体和P2X2受体在同一神经元上共表达，5-HT3受体远端轴突和树突靶向信息传递依赖P2X2受体的表达，且这种5-HT受体还能与其他P2X受体家族成员发生相互作用[15]。本实验室前期实验也发现大鼠大脑皮质神经胶质细胞上5-HT受体和P2X7受体共表达。5-HT含量下降后，可能通过5-HT受体和P2X受体的相互作用，影响P2X7受体的活性及细胞内信号蛋白激酶的活动，改变细胞的功能状态，影响睡眠调节物质如细胞因子的分泌，最终影响大脑皮质的兴奋性活动。

综上所述，脑内5-HT下降后，可通过P2X受体介导细胞内蛋白激酶P38 MAPK、PKC及CaMKⅡ蛋白及基因mRNA的表达变化，本研究有利于进一步明确促眠药物的作用环节和作用的靶点，对新药的研发具有重要的意义。