七叶一枝花地上部分总黄酮的测定研究

张玉霖 余海峰 周亮 张又枝（通讯作者） 陈锦红

（湖北科技学院药学院 湖北 咸宁 437100）

七叶一枝花(Paris polyphylla)为重楼属多年生草本植被，属十分珍贵的药材，有悠久的药用历史，具有抗菌抑菌、止血消炎、抗动脉粥样硬化等药理作用[1]。包括七叶一枝花在内的重楼属植物，其药用成分主要为皂苷、黄酮类等物质[2]。黄酮类化合物具有抗病毒、抗氧化、预防心脑血管疾病、抗肿瘤、清除自由基等多方面的功用[3]。由于目前七叶一枝花常用根部入药，而其地上的茎、叶部分常被丢弃，为更充分利用七叶一枝花的现有资源，测定其茎、叶不同部位总黄酮，给合理利用整株七叶一枝花提供理论依据。本文参考相关文献[4-6]，选用芦丁为对照，利用芦丁和铝的络合物产生荧光的原理来测定七叶一枝花中总黄酮的含量，结果满意。

1.材料与仪器

1.1 材料

七叶一枝花地上茎、叶，采购于长阳泽昊中药材种植基地。芦丁对照品（批号161223，购自上海圻明生物科技有限公司），硝酸铝、乙酸钠、甲醇、无水乙醇、乙酸等均为分析纯。

1.2 仪器

RF-5301型荧光分光光度计(日本岛津)；KQ3200DB型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；万分之一电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；DHG-9140B电热恒温鼓风干燥箱（上海培因实验仪器有限公司）；FW177型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；LDZ4-0.8低速自动离心机（北京医用离心机厂）、PHS-3C型PH计（上海雷磁精密科学仪器有限公司）；RE-5299旋转蒸发仪（郑州市亚荣仪器有限公司）。

2.方法与结果

2.1 七叶一枝花总黄酮的提取方法

将七叶一枝花地上茎、叶分开，除杂洗净，烘干粉碎。按照文献[7]方法，精密称取茎、叶样品粉末各一定量加石油醚脱脂脱色后挥干，按液料比15：1加入90%乙醇超声提取30min，重复提取2次，合并提取液，以90%乙醇定容至50mL。

2.2 测定条件的选择

精密称取芦丁对照品，用90%乙醇配成0.5g·L-1的标准溶液，移取该溶液液0.8mL至25mL容量瓶，加入10% Al（NO3）3溶液1.6mL、不同PH（2.7、3.6、4.5、5.4）的HAC-NaAC缓冲溶液0.8mL，用不同体积分数（50%，70%，90%，100%）乙醇定容，摇匀。考察乙醇体积分数、溶液PH对荧光测定的影响。在激发、发射狭缝宽度均为5nm条件下扫描，测得激发波长=430nm，发射波长=483nm。

不同体积分数（50%，70%，90%，100%）乙醇的影响结果见图1。图1表明，配合物的荧光强度基本随着乙醇体积分数增加而增强，且乙醇体积分数变大后，最大峰位略微向右移动。当乙醇浓度为90%时，荧光强度明显强于其它浓度。所以，本实验选定90%乙醇为测定溶剂。

图1 不同浓度乙醇溶剂的影响

不同PH缓冲溶液的影响见图2，随着溶液PH值的升高，荧光强度值先增高后减弱。可见不同PH的溶液会影响配合物的稳定性。当加入PH=3.6的缓冲溶液时，荧光强度最大，本实验选择加入PH=3.6的HAC-NaAC缓冲溶液。

图2 不同PH的影响

2.3 标准曲线的绘制

分别吸取0.5g·L-1芦丁标准溶液0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.5mL于6只25ml容量瓶中，依次加入10%Al（NO3）3溶液1.6mL及PH=3.6HAC-NaAC缓冲溶液0.8mL，最后用90%乙醇定容，即得芦丁标准工作溶液。以试剂空白为参比，测定各芦丁标准工作溶液的荧光强度，绘制标准曲线。结果表明，芦丁浓度在0.004～0.03g·L-1的范围内与荧光强度呈良好线性关系，回归方程为Y=33573X-13.715，Y表示荧光强度，X表示芦丁浓度，相关系数r2为0.9991。

2.4 精密度试验

取同一份样品溶液平行测定6次，测得溶液中总黄酮浓度分别为 18.742、18.695、18.377、18.421、18.869、18.471ug·L-1，RSD为0.19%，表明方法精密度良好。

2.5 加标回收试验

为了验证本法测定的准确性，在样品溶液中加入芦丁对照品进行考察。准确称取样品6份，再加入不同量芦丁标准溶液，按样品测定方法提取、测定，结果见表。该方法平均回收率为96.55%，说明该方法准确可行。

表 七叶一枝花总黄酮回收率试验

2.6 样品测定

精密量取“2.1”项下茎、叶提取液各一定量，分别加入10%Al（NO3）3溶液1.6mL及PH=3.6HAC-NaAC缓冲溶液0.8mL，用90%乙醇定容至25mL，测定各溶液荧光强度，代入回归方程，求得茎、叶中总黄酮含量分别为4.86、6.12mg·g-1。

3.讨论

本文采用荧光分光光度法测定七叶一枝花总黄酮含量，考察了乙醇溶剂体积分数、溶液PH等对荧光强度的影响。实验表明，在本文实验条件下，芦丁浓度在0.004～0.03g·L-1范围内与荧光强度有良好的线性关系，平均回收率为96.55%。荧光法对比传统的紫外分光光度法灵敏度更高，且操作简单，可以作为测定七叶一枝花总黄酮含量的方法。样品测定结果表明，七叶一枝花地上的茎、叶中含有丰富的黄酮类化合物，可以充分利用。