研究不同取材时间对4NQO诱导大鼠口腔鳞癌模型的差异

张晓艳 谭红 周骢 聂敏海

（西南医科大学附属口腔医院 四川 泸州 646000）

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC，简称口腔鳞癌)是位居第18的危害人类健康的恶性肿瘤[1]。希望通过体外模型或动物模型来研究分析口腔鳞癌的发生发展过程，为其治疗提供思路和依据。

口腔鳞癌的发生、转变和致病过程是复杂多变的。Hawkins等[2]发现，4-硝基喹啉-1-氧化物（4-Nitroquinoline-l-oxide，4NQO）饮水法诱导大鼠口腔黏膜癌变的过程与人口腔黏膜癌变过程相似，该大鼠模型的建立有利于研究人口腔鳞癌的发生发展。通过时间变量的影响，以期得到在屏障环境下，4NQO诱癌模型的较优选择。

1.材料与方法

1.1 实验材料

165只6周龄雄性SD大鼠(成都达硕生物有限公司提供)，体重约200～220g；屏障环境，室温20～25℃，湿度40%～60%，灯光模拟自然循环。纯净无菌饮水和SPF级动物专用灭菌固体饲料喂养(成都达硕生物有限公司提供)，系统实验物品均经消毒灭菌后传送进入；4NQO(Sigma公司,美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 SD大鼠165只，随机分11组,每组15只。实验组1为A、B、C、D、E组，实验组2为A1、B1、C1、D1、E1组，F组为空白对照组。实验大鼠分别于第10周(A)、12周（A1）、14周(B)、15周（B1）、18周(C、C1)、21周（D1）、22周(D)、24周(E1)、26周（E、F）分9批处死。对照组F于26周同期处死。

1.2.2 制质量分数0.025%的4NQO水溶液，4℃冰箱避光保存。饲育时稀释为质量分数0.004%置遮光瓶内。对照组饮灭菌水置普通塑料瓶内。全组每周换水3次，瓶内残余水做无害化废弃处理。

1.3 观察指标

1.3.1 观察大鼠的行为和精神状态，每周称重1次；2周观察口腔黏膜情况，并记录。

1.3.2 处死取舌、双颊、腭、食道的黏膜和颈淋巴结、肝及脾的组织标本，观察标本的组织病理学变化。苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色切片，光学显微镜下观察病理改变。病理分级为正常黏膜，上皮单纯性增生，轻度、中度、重度上皮异常增生，口腔鳞癌。上皮异常增生的诊断参考世界卫生组织2005年标准[3]。

1.4 统计学方法

实验所获病理分级数据用等级资料两样本的秩和检验，统计学检验水准为α=0.05,P＜0.05有统计学意义。

2.结果

2.1 实验共获得有效动物模型156只，斗殴死亡2只，麻醉意外死亡1只，衰竭死亡6只。

2.2 SD大鼠进入屏障环境2周后饮食饮水趋于正常。

2.3 观察发现对照组口内均较清洁，舌色粉，柔软富弹性，无肉眼可见改变。实验组从9周开始，舌逐渐出现粗糙不平，缺乏光泽，白色样变，舌体萎缩、弹性降低。18周后口腔清洁较差,黏膜水肿，偶伴充血糜烂面、偶见新生物和溃疡面。22周后发现部分大鼠颊部新生物，伴舌根溃疡。各组全程均未出现大鼠口腔黏膜组织坏死。

2.4 大鼠模型病理分级结果如表1所示。

表1 实验各组病理分级表

经等级资料两样本的秩和检验，示不同时间对模型的影响不同，差异有统计学意义（当ν→∞时，按α=0.05，Z=1.66,0.01＜P＜0.05）。

在收集的标本中各阶段病变占当组的比例如表2所示，可知实验组1前期模型的成模率比重较高，而实验组2后期的成模率比重较理想。

表2 各阶段病变在各组中的比例

实验表3，各阶段所得标本总数占实验总数的比例，正常黏膜的数目最多，其余各阶段数目基本一致。后期病理检查发现，所有标本中，2例食管鳞癌，1例淋巴转移，未发现肝和脾等的明显病理改变。

表3 各阶段模型占模型总数的比例

3.讨论

在常用的口腔鳞癌诱导剂4NQO和二甲基苯并蒽(10-dimethyl-1,2-benzanthracene,DMBA)间，因DMBA诱导的模型易出现组织炎症反应和坏死[4]，因此4NQO诱癌模型自出现[5]就被认可，该大鼠模型对口腔鳞癌的研究有重要意义。本研究在屏障系统下用4NQO饮水法成功建立大鼠模型，将口腔鳞癌的连续过程展现，突显了4NQO的诱癌作用。

实验中同一时间范围内，相同因素下饲养的大鼠可能有相似或相同的病理改变，但因个体差异使病变程度不一。随时间推移，向癌转变的概率增高，发展迅速。本研究说明在4NQO诱癌过程中，10周后开始出现各个阶段病理改变，在24周后逐渐转化为鳞癌。实验组1取材较早，间隔4周，获得上皮单纯性增生和轻度上皮异常增生的有效标本较多，后期各阶段的标本稍不足。而实验组2的取材时间推迟，间隔3周，前期各阶段有效标本稍不足，中度、重度上皮异常增生和鳞癌标本较均衡。经秩和检验发现，总的来说实验组1的取材时间优于实验组2。在10周左右开始取材，综合两实验组的间隔时间，所得标本可能各阶段较均衡，但该方法有待实验进一步验证。

在舌癌早期会出现颈淋巴结转移，浸润深度和转移率与肿瘤的直径、分级、生长方式、分化程度是否有相关性尚有待研究[6]。口腔作为消化道起始，模型中未发现食管黏膜上皮异常增生，仅2例食管黏膜上皮癌，1例淋巴转移。考虑其可能原因是4NQO致癌有一定的靶向性；也可能是造模时间相对较短，口内原发灶未转移，但并不排除可能存在的隐匿性颈淋巴结转移及微转移。阻断转移是癌前状态到鳞癌的关键点，也是目前亟待解决的问题[7]。

总的来说，4NQO饮水法建立大鼠口腔鳞癌模型的方法较简便、靶器官较明确、病变典型，过程相对稳定，癌变时间相对可控可循，整个过程与人口腔鳞癌的过程相似，该模型是研究口腔鳞癌的理想模型[8]，优化该模型对研究口腔癌前病变、鳞癌的发生发展和鳞癌的治疗预防都有深远意义[9]。