黄化变异对英红九号红茶香气的影响

陈维，祁丹丹，王雯雯，苗爱清，庞式，马成英

（1.广东省农业科学院茶叶研究所，广东省茶树资源创新利用重点实验室，广东广州 510640）

（2.安捷伦科技（中国）有限公司，北京 100102）

叶色变异茶树资源不仅外观独特，所制成茶也普遍品质独特。根据芽叶颜色的不同，叶色突变茶树可被分为白化、黄化和复色（花叶）变异三类[1]。尽管它们在外观上不尽相同，但叶片颜色的转变均主要源于叶绿体发育异常和叶绿素合成受阻[2～4]；而这也会直接影响茶树正常光合作用和代谢物质积累，进而引起所制成茶品质的转变。

相较于叶色正常茶叶，白化或黄化原料所制成茶大多色泽浅嫩、滋味鲜爽，这与鲜叶中品质相关成分的转变关系密切。现时，针对叶色变异茶叶品质成分的研究主要集中在非挥发组分上，如与干茶颜色相关的叶绿素和其他色素，以及与鲜醇滋味相关的氨基酸和多酚类物质[5～9]。

香气也是茶叶中重要的感官品质之一，是衡量茶叶品质的重要指标。成茶香气的形成受鲜叶中内涵物质的影响极大，白化或黄化茶叶内多种生化成分的改变或会进一步导致成品茶香气的变化。然而，针对叶色变异茶叶香气的报道相对较少。现有的研究主要集中在叶色变异红绿茶香气成分的分析与比较上[10～16]，选取的叶色正常对照茶样来源于不同茶树品种；由于样品间遗传背景的不同，因此反映出的香气差异并非完全是叶色变异的结果。虽然也有关于光敏白化品种“白鸡冠”自然白化与遮光复绿叶片香气差异的报道[17]，但遮光处理本身也会引起茶叶香气的转变[18]。目前，叶色变异对成茶香气品质影响的不确定，不利于相关茶树资源的进一步开发利用。

英红九号是从云南大叶群体种中选育出的无性系品种[19]。近年来，我们从该品种中获得了黄化变异材料。前期的研究已从叶色、叶绿体结构、离子组学、蛋白组学多个角度分析了黄化和叶色正常英九之间的差异，阐释了叶色变异的可能成因[2]。

由于黄化与叶色正常英红九号的遗传背景相似，因此该材料不仅适用于分析叶色变异的机理，也是有利于研究叶色变异对成茶品质的影响。本文以黄化变异与叶色正常英红九号的一芽二叶为原料加工红碎茶，通过感官审评分析黄化对红茶感官香气表现的影响；利用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用法提取并表征其中的香气化合物；进一步结合化学计量学手段，查明黄化变异对红碎茶香气组成和含量的影响，分析与感官香气转变的联系；并对两组样品的差异成分进行基于衍生途径的分类，讨论引起香气变化的可能原因。

1 材料与方法

1.1 材料和主要仪器设备

1.1.1 实验材料

茶青原料：黄化变异英红九号（突变材料，HY）与叶色正常英红九号（对照材料，CK）茶叶如图 1所示。两种茶青原料按一芽二叶标准于2016年6月在广东英德采收。

试剂：C7～C40饱和正构烷烃混合标准品（美国Supleco公司）；癸酸乙酯（色谱纯）（美国Sigma-Aldrich公司）。

图1 黄化英红九号（HY）与叶色正常英红九号（CK）的表型Fig.1 The phenotype of the chlorina (HY) and normal (CK)Yinghong9

1.1.2 主要仪器设备

7890B-7000D气相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪（gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，GC/MS/MS），美国Agilent公司；DB-5MS毛细管色谱柱（60 m×0.32 mm，0.25 μm），美国Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，美国Supleco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 红碎茶样品的制备

将黄化变异与叶色正常英红九号鲜叶对半铺于萎凋槽上，在室温下实施鼓风萎凋使茶青含水量降至约60%。萎凋后茶青通过转子机搅碎，28～32 ℃发酵40 min，80 ℃提香机干燥3 h至含水量6%左右，制得黄化和对照英红九号红碎茶。为减少加工工艺对成茶香气的影响，每种原料在萎凋后分别取样3次并重复余下工艺，即获得每组各3份加工重复样。

1.2.2 红碎茶香气的感官审评

参照茶叶感官审评标准GB/T 23776-2009着重对红碎茶样品的感官香气进行审评[20]，其中香气评分由各组3份加工重复样品的评分均值确定。

1.2.3 顶空固相微萃取条件

准确称取3.5 g茶样，放入150 mL顶空瓶中，加入10 μL癸酸乙酯溶液（0.2 μg/μL）作为内标监控萃取的重复性，随后注入10 mL沸水，迅速拧紧顶空瓶瓶盖。将萃取装置转移到65 ℃水浴中平衡5 min，随后插入萃取装置，在65 ℃吸附40 min。进样时，萃取头在GC/MS/MS进样口处解吸附4.5 min。每份重复样品萃取并进样测定1次。

1.2.4 气相色谱与质谱条件

气相条件：进样口运行不分流模式，温度保持在270 ℃。以氦气为载气，流量设置为1 mL/min。程序升温：初始柱温50 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min。质谱条件：选用电子轰击离子源（EI源），电子能量设为 70 eV，传输线温度为280 ℃，离子源温度为 280 ℃，四极杆温度均设为150 ℃；运行全扫描模式，扫描质量范围设定为35～450 m/z；设2 min溶剂延迟时间。

1.3 数据分析

由GC/MS/MS采集得到的数据，利用Masshunter工作站中的未知物分析软件（Unknowns Analysis，Version B.08.00，美国Agilent公司）进行处理。化合物依据质谱匹配度和线性保留指数定性；通过比对NIST14库，选取质谱匹配度大于75.0且保留指数接近报道值（偏差在±5个单位内）的化合物用于后续分析。其中，线性保留指数的计算方法参照Van den Dool和 Kratz的定义与 Babushok等的报道的计算公式[21,22]。由于两组样品间癸酸乙酯内标的峰面积接近（表2）且差异不显著（t检验，p≥0.05），说明实验重复性良好；故参考相关文献[23]，采用基峰面积对定性后化合物进行定量。

将定性定量后的数据组导入化学计量学分析软件Mass Profiler Professiona（lVersion B.14.9，美国Agilent公司）进行差异化合物筛选和计量学分析。通过以 2为底数的对数变换和Z-transform标准化（减均值除以标准差）的数据组，按以下参数逐步过滤化合物：（1）组内最小出现频次大于50%；（2）t检验中显著差异p值小于0.05。对筛选出的差异化合物分别进行主成分分析（Principle Component Analysis，PCA），层次聚类分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）和维恩图分析（Venn diagram）；同时参考文献[24～27]，依据涉及的衍生途径对差异化合物进行分类，以揭示黄化变异对红碎茶香气的影响。

2 结果与讨论

2.1 黄化变异与叶色正常英红九号红碎茶感官香气的比较

黄化变异与叶色正常英红九号红碎茶的感官香气品质和香气评分如表1所示。两组样品虽均表现出鲜甜的香气特征，但黄化红茶整体香气浓度较低，尤其在甜度和鲜度上均不如对照样品突出。

表1 黄化变异与叶色正常英红九号红碎茶的感官香气品质及评分Table 1 The sensory aroma quality and score of the CTC black tea prepared by the chlorina and normal Yinghong9

2.2 黄化变异与叶色正常英红九号红碎茶香气化合物组成和含量的比较

从黄化变异与叶色正常英红九号红碎茶中一共鉴别出56种香气化合物，其中黄化样品中有47种，对照样品中55种。这些化合物的线性保留指数、定性与定量结果以及部分香气品质均列于表 2。两组样品的总离子色谱图如图2所示。从化合物的分类上看，56种化合物中有15种醇类、14种醛类、10种烃类、9种酯类、4种酮类以及4种含氧化合物。

表2 黄化变异（HY）与叶色正常（CK）英红九号红碎茶香气化合物的组成和含量Table 2 The compositions and contents of VOCs between the CTC black teas prepared by the chlorina (HY) and normal (CK)Yinghong9 (±s )

表2 黄化变异（HY）与叶色正常（CK）英红九号红碎茶香气化合物的组成和含量Table 2 The compositions and contents of VOCs between the CTC black teas prepared by the chlorina (HY) and normal (CK)Yinghong9 (±s )

编号 化合物 线性保留指数 基峰面积（×104） 香气品质i HY CKⅠ 组成差异化合物1 1-辛烯-3-醇 978 6.20±0.65 -ii 蘑菇气味[28]2 乙酸叶醇酯 1003 - 1.77±0.12 青气、香蕉气味[28]3 对甲基异丙基苯 1026 - 4.56±0.28 柑橘气味[28]4 丁酸己酯 1190 - 4.87±0.28 苹果皮气味[28]5 橙花醇 1226 - 7.31±0.46 柑橘气、花香[28]6 顺-3-己烯醇-2-甲基丁酸酯 1230 - 8.50±0.48 甜香、香草气[28]7 己酸-顺-3-己烯酯 1383 - 6.51±0.35 果香、干果香[28]8 α-法呢烯 1504 - 2.05±0.06 木香、甜香[28]

9 δ-杜松萜烯 1525 - 2.32±0.22 百里香、药香、木香[28]10 植醇 2110 - 1.26±0.34 花香[28]Ⅱ 含量差异化合物(p＜0.05)11 甲苯 763 21.07±0.75 18.95±0.41 油漆气味[28]12 3-糠醛 830 11.90±1.29 8.86±1.08 未查得13 反-2-己烯醛 850 22.80±0.87 29.12±1.84 青味、绿叶气[28]14 反-2-己烯-1-醇 862 2.19±0.20 6.90±0.26 青味、绿叶气、核桃气味[28]15 正己醇 865 1.04±0.04 2.35±0.37 松香、花香、青香[28]16 2-庚醇 900 8.30±1.22 12.06±0.23 未查得17 反,反-2,4-己二烯醛 911 4.29±0.43 6.39±0.16 青气[28]18 β-香叶烯 988 14.78±1.59 21.89±1.01 葡萄醋、葡萄果浆气味[28]19 2-戊基呋喃 989 17.38±2.42 22.31±1.43 未查得20 反,反-2,4-庚二烯醛 1012 28.47±1.30 40.00±0.88 果仁香、油脂气[28]21 柠檬烯 1031 4.13±0.48 6.00±0.36 柠檬气味、橙子气味[28]22 β-罗勒烯 1046 20.02±0.96 23.84±1.10 甜香、香草气[28]23 苯乙醛 1047 846.34±19.29 719.02±37.01 蜜香、甜香[28]24 1-乙基-1H-吡咯-2-甲醛 1051 13.26±0.53 16.65±0.67 烘烤气味、焦气味[28]25 反-2-辛烯醛 1058 1.47±0.09 2.47±0.12 青气、果仁香、油脂气[28]26 反,反-3,5-辛二烯-2-酮 1069 6.17±0.33 7.39±0.65 果香、油脂气、蘑菇香气[28]27 芳樟醇氧化物Ⅰ 1073 6.20±0.39 9.45±0.44 甜香、花香[29]28 芳樟醇氧化物Ⅱ 1089 19.38±1.17 26.79±1.43 甜香、花香[29]29 芳樟醇 1103 296.00±15.92 466.76±16.97 花香、紫罗兰香[28]30 苯乙醇 1116 23.31±0.64 37.80±1.57 蜜香、玫瑰香[28]31 反-2-壬烯醛 1160 1.24±0.06 1.39±0.01 黄瓜气味、青气、油脂气[28]32 正壬醇 1171 1.91±0.12 1.46±0.07 油脂气、柑橘香、青气[28]33 丁酸-顺-3-己烯酯 1184 4.83±0.35 25.14±1.71 青气、酒香[28]34 水杨酸甲酯 1197 55.92±0.25 78.89±2.40 薄荷香[28]35 藏红花醛 1204 3.94±0.24 2.44±0.10 香草气、甜香[28]36 癸醛 1206 2.37±0.22 2.05±0.07 橙子皮气味、肥皂气味[28]37 β-环柠檬醛 1224 4.30±0.20 5.05±0.22 柠檬香[28]38 3-苯基呋喃 1227 5.15±0.18 4.24±0.03 青气、果仁香[30]39 异香叶醇 1241 0.98±0.03 1.34±0.10 玫瑰香[28]40 香叶醇 1250 17.95±0.18 22.45±1.35 玫瑰香、天竺葵香[28]41 2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-乙醛 1261 2.12±0.10 2.63±0.13 未查得42 2-苯基-2-丁烯醛 1272 6.68±0.19 4.73±0.25 可可气味、烘烤气味[30]43 2-甲基萘 1305 6.42±0.70 4.99±0.53 未查得44 茶螺烷 1323 4.12±0.17 3.68±0.12 黑醋栗气味、樟脑气味[31]45 己酸-顺-3-己烯酯 1379 10.34±0.18 54.76±4.10 果香、干果香、甜香[28,32]46 己酸-反-2-己烯酯 1387 5.36±0.09 25.53±1.59 青草气、果香、刺鼻气味[33]47 α-紫罗兰酮 1428 2.03±0.10 3.39±0.13 木香、紫罗兰香[28]48 香叶基丙酮 1448 5.80±0.99 4.24±0.32 木兰香、青气[28]49 β-紫罗兰酮 1484 20.53±0.41 28.13±0.87 花香、紫罗兰香[28]

注：i.表中仅列出组成或含量差异化合物的香气品质；ii.“-”表示该化合物未在样品组中检出。

图2 黄化变异（HY）与叶色正常（CK）英红九号红碎茶的总离子色谱图Fig.2 The total ion chromatographies of the CTC black teas prepared by the chlorina (HY) and normal (CK) Yinghong9

以出现频次（＞50%）和显著性（p＜0.05）为依据，通过Mass Profiler Professional软件从56种香气成分中筛选出差异化合物49种。选取这些化合物进行主成分分析（PCA），结果如得分图（图3）所示，前两个主成分（PC1和PC2）的方差贡献率分别为91.0%和5.4%，即累计方差贡献率达到96.4%，基本涵盖了原数据组中的信息。6份红碎茶样品按黄化与对照处理分别归为两类，并在PC1方向上有清晰的区分。PCA的结果表明，49种差异化合物能很好地反映茶叶黄化变异对红碎茶香气的影响。

图3 基于黄化变异（HY）与叶色正常（CK）英红九号红碎茶间49种差异化合物的PCA得分图Fig.3 The PCA score plot based on the 49 differential VOCs between the CTC black teas prepared from the chlorina (HY)and normal (CK) Yinghong9

49种组成和含量差异化合物在黄化变异与叶色正常英红九号红碎茶间的分布如维恩图（图4）所示。黄化红碎茶中有差异化合物 40种，对照红碎茶中有48种。其中，在两组样品内均能被检出的化合物有39种，占差异组分的79.6%；仅出现于对照组的化合物有9种，占18.4%；仅出现于黄化组的化合物只有1种，占2.0%。可见，两组红碎茶间以含量差异化合物为主（39种），组成差异化合物其次（10种）；同时，从化合物种类上看，黄化红碎茶的香气成分较对照中的少。为进一步分析39种含量差异化合物在黄化与对照红碎茶之间的变化情况，基于它们进行层次聚类分析，结果以树状图辅以热度图的形式表示（图5）。树状图将39种化合物清晰地分为两类：类Ⅰ包含12种在黄化红碎茶中含量较高的香气化合物，其中藏红花醛（1.61倍）表现出较大的差异倍数（表2）；类Ⅱ包含27种在对照红碎茶中含量较高的香气化合物，其中己酸-顺-3-己烯酯（5.30倍）、丁酸-顺-3-己烯酯（5.21倍）、己酸-反-2-己烯酯（4.76 倍）、反-2-己烯-1-醇（3.15倍）、正己醇（2.25倍）、反-2-辛烯醛（1.67倍）、α-紫罗兰酮（1.67倍）、苯乙醇（1.62倍）、芳樟醇氧化物I（1.58倍）和芳樟醇（1.53倍）的差异倍数较大，均达到1.5以上（表2）。可见，多数含量差异化合物表现出在黄化红碎茶中较低，而在对照红碎茶中较高的现象。

图4 基于黄化变异与叶色正常英红九号红碎茶间49种差异香气化合物的维恩图Fig.4 The Venn diagram based on the 49 differential VOCs between the CTC black teas prepared by the chlorina and normal Yinghong9

图5 基于黄化变异（HY）与叶色正常（CK）英红九号红碎茶间39种含量差异化合物的HCA树状图和热度图Fig.5 HCA dendrogram and heatmap based on the 39 content-differential VOCs between the CTC black teas prepared by the chlorina (HY) and normal (CK) Yinghong9

2.3 黄化变异与叶色正常英红九号红碎茶间香气化合物和感官香气变化的联系

茶叶感官香气的转变是香气化合物组成和含量变化的结果。与叶色正常英红九号红碎茶相比，黄化红碎茶在香气的甜度、鲜度以及整体浓度上均较弱（表1）。从56种香气成分中共筛选差异化合物49种（表2）；基于它们的 PCA能清晰地区分黄化与对照样品（图3），说明这49种化合物很好地反映了两组红碎茶间的香气组成和含量差异，或与感官香气的转变较具联系。黄化红碎茶感官香气甜度的降低可能与丁酸己酯、橙花醇、顺-3-己烯醇-2-甲基丁酸酯、己酸-顺-3-己烯酯、α-法呢烯和叶绿醇的缺失，以及β-罗勒烯、芳樟醇氧化物Ⅰ、芳樟醇氧化物Ⅱ、芳樟醇、苯乙醇、异香叶醇、香叶醇、己酸-顺-3-己烯酯、己酸-反-2-己烯酯、α-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮含量的显著减少相关（表2）。这些化合物普遍具有甜香、果香或花香的感官品质（表2），其中芳樟醇氧化物Ⅰ和Ⅱ、芳樟醇、苯乙醇、香叶醇、α-紫罗兰酮以及β-紫罗兰酮具有较低的香气阈值[34]。同时，反-2-己烯醛、反,反-2,4-己二烯醛、β-香叶烯、柠檬烯和水杨酸甲酯也是红茶中重要的呈香物质[33,35]。它们在黄化红碎茶中显著的减少（表 2）也可能是导致其整体感官香气浓度弱于对照样品的原因之一。值得注意的是，少数红茶中常见的呈香物质如苯乙醛（蜜香、甜香）、藏红花醛（香草气、甜香）和香叶基丙酮（木兰香、青气）[33,35]有在黄化红碎茶中表现出显著上升的趋势（表2）。

2.4 黄化变异与叶色正常英红九号红碎茶间差异香气化合物基于衍生途径的分类

从差异化合物的比较中可以看出，黄化变异会引起英红九号红碎茶中多种香气组成和含量的改变。为观察不同衍生途径相关香气在不同样品间的变化趋势，基于文献报道的香气来源对多数差异化合物分类[24～27]，结果如图 6 所示。茶叶中的香气主要来源于脂肪酸和类胡萝卜素的氧化、以及萜类和莽草酸代谢[26]。根据衍生途径的不同，黄化与对照红碎茶间的差异香气化合物主要可被分为四类：脂肪酸衍生香气、类胡萝卜素衍生香气、萜类香气和苯丙素/苯型类香气[36]。其中，脂肪酸衍生香气的种类最多共19种，包括1-辛烯-3-醇、乙酸叶醇酯、丁酸己酯、顺-3-己烯醇-2-甲基丁酸酯、己酸-顺-3-己烯酯、反-2-己烯醛、反-2-己烯-1-醇、正己醇、2-庚醇、反,反-2,4-己二烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反-2-辛烯醛、反,反-3,5-辛二烯-2-酮、反-2-壬烯醛、正壬醇、丁酸-顺-3-己烯酯、癸醛、己酸-顺-3-己烯酯和己酸-反-2-己烯酯。它们多数在黄化样品中含量较低或缺失。类胡萝卜素衍生香气有8种，其中半数以上化合物如α-法呢烯、β-环柠檬醛、2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-乙醛、α-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮在黄化红碎茶中含量较低或缺失，而藏红花醛、茶螺烷和香叶基丙酮则在对照中含量较低。萜类香气有11种，包括橙花醇、δ-杜松萜烯、植醇、β-香叶烯、柠檬烯、β-罗勒烯、芳樟醇氧化物Ⅰ、芳樟醇氧化物Ⅱ、芳樟醇和香叶醇。它们均在黄化组中表现出含量降低或缺失。苯丙素/苯型类香气有3种，其中苯乙醛在黄化样品中有较高含量，而苯乙醇和水杨酸甲酯则含量较低。总体而言，两种红碎茶间的差异香气化合物主要涉及与脂肪酸、类胡萝卜素氧化以及萜类代谢相关的衍生途径。脂肪酸衍生香气和萜类香气在两组红碎茶间的变化趋势较一致，即在黄化组中含量较低或缺失，而半数以上的类胡萝卜素衍生香气也表现出类似变化趋势。

图6 差异香气化合物基于衍生途径的分类Fig.6 The classification of the differential VOCs based on the biosynthesis pathways

2.5 黄化变异引起英红九号红茶香气化合物转变原因的推测

鲜叶中的物质基础对成茶香气的形成影响关键。前期研究表明，黄化英红九号叶片中的绿体数量较少且结构异常[2]，这必然会影响叶片正常的光合作用和代谢物质的积累。黄化与对照英红九号红碎茶香气间的差异可能来源于此。从基于来源的化合物分类上看，两种红碎茶间的差异香气化合物主要涉及与脂肪酸、类胡萝卜素氧化以及萜类代谢相关的衍生途径（图6）。黄化英红九号中叶绿体的缺失和异常可能会影响香气衍生途径中部分代谢物的合成、积累或转化。叶绿体作用于叶片中脂肪酸的合成[37]，而位于其中的脂氧化酶也对脂肪酸向香气的转化影响关键[27]；同时叶绿体也是部分胡萝卜素的合成和积累的场所[38,39]；与单萜、二萜等萜类香气合成相关的 MEP（Methylerythritol 4-phosphate）途径也需在叶绿体等质体中实施[40,41]。因此，叶绿体发育异常或是引起脂肪酸、类胡萝卜素衍生香气和萜烯类香气变化的原因之一。

3 结论

3.1 相较于叶色正常样品，黄化变异英红九号所制红碎茶在感官香气的整体浓度有所减弱，尤其在甜度与鲜度上。从化合物的变化上看，黄化与对照红碎茶间有差异化合物49种，基于它们的主成分分析对两组样品有很好的区分。10种化合物有组成差异，其中黄化样品的香气种类较少；39种化合物有含量差异，其中28种化合物在黄化样品中显著下降，11种显著上升。

3.2 丁酸己酯、橙花醇、顺-3-己烯醇-2-甲基丁酸酯、芳樟醇氧化物Ⅰ和Ⅱ、苯乙醇、β-紫罗兰酮等香气化合物在黄化红碎茶中缺失或减少，可能与香气甜度的减弱相关；而反-2-己烯醛、反,反-2,4-己二烯醛、β-香叶烯、柠檬烯和水杨酸甲酯的显著降低也可能是导致黄化红碎茶整体香气浓度减弱的原因之一。

3.3 黄化变异与叶色正常英红九号红碎茶间的差异香气化合物主要涉及与脂肪酸、类胡萝卜素氧化以及萜类代谢相关的衍生途径。