固相萃取法-气相色谱-质谱法快速测定水果中36种农药残留

周雪 ，陈婷婷 ，李婉蓉 ，刘学 ，吴林菁 ，张嫩玲

（1.贵州医科大学中药药剂学教研室（贵州省特色药用植物资源高效利用工程中心，贵阳市-贵州医科大学天然药物药理与成药性评价联合实验室，贵州省普通高等学校天然药物药理与成药性评价特色重点实验室，贵州医科大学天然药物资源优效利用重点实验室），药学院，贵州医科大学，贵州贵安 550025）

（2.省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室（贵州医科大学），贵州贵阳 550014）

水果是百姓餐桌上每天的必备食品，与我们的生活息息相关。农药是农产品生产过程中必不可少的原料，但是，近些年由于使用者普遍缺乏科学使用农药的知识，片面追求产量或延长保存期限，造成目前市场上流通的水果都不同程度地存在农药残留问题，对人体的健康造成一定危害。

目前，农残的检测方法主要有色谱法及色谱-质谱联用法，特别是多组分农药残留的定量检测及筛查多集中于色谱串联单极质谱（MS）定量、色谱串联三重四级杆质谱（MS/MS）定量及飞行时间质谱（TOF-MS）筛查等方式[1～4]，而其中的气相色谱-质谱联用技术既具有气相色谱的高分离效能，又利用了质谱准确鉴定化合物结构的特点，特别是应用三重四级杆质谱仪的多反应监测模式（MRM）监测，它能有效的消除杂质干扰，提高灵敏度，已广泛应用于农药残留检测中[5]，但截止到目前水果中农药残留检测的国家标准中还未利用MRM模式进行定量，大多数定量模式还是要依靠单离子模式（SIM）检测。所以在SIM采集模式下，要想降低杂质的离子串扰问题，那么前处理中的净化阶段就显得非常重要[6]。通常水果基质的净化方式主要以分散固相萃取(MSPD)法和固相萃取（SPE）法居多[7,8]，虽然MSPD法操作简单，快捷，特别适合批量处理。但是作者在实验中发现，MSPD法净化效果不如SPE法对杂质的净化更彻底，且相关国家标准中多数是利用SPE净化。目前我国颁布的多组分农残检测的国标及行标主要有 NY/T 761-2008、GB/T 5009.218-2008及GB 23200.8-2016等，NY/T 761-2008主要是利用气相色谱法对蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药的测定，但气相色谱的灵敏度低，且仅靠保留时间定性，而蔬菜水果基质复杂，当前处理净化不当容易导致杂质干扰严重从而发生错判。GB/T 5009.218-2008为水果及蔬菜中多种农药残留量的测定，该法前处理步骤繁琐，不仅需要凝胶净化，还需要旋转蒸发进行多次浓缩，耗时较长。所以本研究在参照相关的国家标准及文献基础上，通过实验比较常用的3种固相萃取柱的净化效果，选择出可靠的净化柱，并结合气相色谱-质谱法测定以无籽提为代表的水果中典型的36种有机氯、菊酯类农药残留，本方法与相关的国家标准相比，操作更加简单[9]，实验结果满意，可对仁果类及小型攀缘类水果中的多组分农药残留进行准确的定量检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

布鲁克Scion-TQ三重四级杆质谱联用仪，美国BRUKER公司；MiLL-Q去离子水发生器，美国Millipore公司；T10高速均质仪，德国IKA公司；高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；HGC-36A氮吹仪。

7种菊酯混标，1000 μg/mL，美国O2Si公司；其余29种农药标准品均购于农业部环境保护科研监测所；无水Na2SO4，NaCl，优级纯，天津科密欧试剂公司；甲醇、乙腈、丙酮(色谱纯)，美国TEDIA公司；Carb/NH2固相萃取柱(500 mg/6 mL)，杭州富裕科技服务有限公司；Cleanert PC/NH2固相萃取柱(1000 mg/6 mL)，天津博纳艾杰尔公司；Pro Elut TPC固相萃取柱(6 mL)，迪马公司；苹果、梨、无籽提购于贵阳超市。

1.2 检测方法

1.2.1 标准储备液及工作液的配制

分别称取36种农药(23种有机氯农药及13种菊酯农药)标准溶液用丙酮溶解并定容至10 mL，配置成单个标准溶液，然后吸取不同体积的单个标准溶液混匀后配置成混合标准溶液，-4 ℃保存，待用。

1.2.2 样品制备

切取水果试样(梨、苹果、提子)的食用部分放入食品加工机内搅碎匀浆，过滤，称取20 g水果滤液试样于50 mL离心管中，加入2×20 mL乙腈，用均质器在15000 r/min匀浆提取1 min，加入5 g NaCl，再匀浆提取1 min，将离心管放入离心机，在10000 r/min冷冻离心5 min，取上清液全部转移到旋转蒸发瓶中，浓缩至1 mL左右，待净化。在Cleanert PC/NH2柱中加入约1 cm高无水硫酸钠，加样前先用5 mL乙腈-甲苯溶液(3+1)预洗柱，当液面到达硫酸钠的顶部时，迅速将样品浓缩液转移至净化柱上，再每次用4 mL乙腈-甲苯溶液(3+1)分三次洗涤样液瓶，并将洗涤液移入柱中。收集洗脱液氮吹至近干，加入1 mL正己烷混匀后，用于气相色谱-质谱测定。

1.2.3 仪器条件

色谱柱：Agilent DB-5MS石英毛细管色谱柱(30×0.25 mm×0.25 μm)，载气：氦气，纯度≥99.999%；CID气：氩气，分流模式：不分流进样，进样口温度：250 ℃，电离模式：电子轰击离子化(EI)，电离能量：70 eV，分析模式：SIM，离子源温度：230 ℃，传输线温度：280 ℃，恒线速度：44 cm/s，进样量：1.0 μL。程序升温条件：起始温度50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至240 ℃保持4 min，再以10 ℃/min升至280 ℃保持4 min，共40 min。溶剂延迟14.0 min。

表1 36种农药保留时间及质谱条件参数Table 1 Retention times and GC/MS conditions of the 36 Pesticide

31 Cypermethrin（氯氰菊酯）35.57 35.84 35.85 35.86 C22H19Cl2NO3 832.59 52315-07-8 15 181 152 180 -32 Flucythrinate(氟氰戊菊酯) 35.82 36.21 C26H23F2NO4 451.48 70124-77-5 15 163 206 226 199 33 Silafluofen(氟硅菊酯) 36.34 C25H29FO2Si 408.20 105024-66-6 100 258 287 286 -34 Fenvalerate(氰戊菊酯) 36.96 37.28 C25H22ClNO3 419.90 51630-58-1 15 225 161 181 419 35 Tau-fluvalinate(氟胺氰菊酯) 37.20 37.31 C26H22ClF3N2O3 502.10 102581-06-9 100 250 252 181 208 36 Deltamethrin(溴氰菊酯) 38.02 C22H19Br2NO3 505.24 52918-63-5 30 181 251 172 174

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂体积及提取次数优化

在农残检测中常用的萃取溶剂有乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、甲醇等。因为乙腈的通用性强，对农药的提取效率高，因此大多数农残检测的前处理都采用乙腈作为提取液[10]。本研究考察了提取溶剂乙腈的体积及提取次数对提取效率的影响，即在GC/MS检测后的空白无籽提汁基质中添加各组分浓度为500 ng/mL的混合标准溶液1 mL，提取溶剂为乙腈，在其他操作条件相同条件下，分别比较提取溶剂10 mL提取2次、提取溶剂20 mL提取1次、提取溶剂20 mL提取2次的提取效果，最终以3次的平均值计算，以回收率作为验证指标，结果显示：即当提取溶剂20 mL提取2次的提取效果要优于提取溶剂20 mL提取1次及提取溶剂10 mL提取2次的提取效果，各组分的峰面积较大。所以实验中均已提取溶剂为乙腈，提取样品2次，每次乙腈提取液体积为20 mL。

2.2 净化条件-固相萃取柱的选择及优化

基质的净化步骤对最终的定量结果有着重要的影响。在分散固相萃取中常用的吸附剂有PSA、Cleannert NH2、C18和石墨化碳黑（GCB）等[11,12]。其中 PSA与Cleannert NH2对有机酸、色素、糖及脂肪等极性共提取物有较好的吸附能力；C18对除去非极性杂质有很好的效果；而 GCB对色素、甾醇类和非极性干扰物有强烈的吸附作用，但同时也会吸附平面结构的农药[13]。而固相萃取柱中的净化填料也大致相同，所以本研究选用了常见的水果及蔬菜农残中常用的净化柱，比较净化效果及对目标物定量的影响，即分别选取Carb/NH2、PC/NH2、TPC三种固相萃取柱，在空白提子汁基质中准确添加各组分浓度为500 ng/mL的混合标准溶液1 mL，在相同的处理条件下利用不同固相萃取柱净化后的结果及3种净化效果较好的固相萃取柱的添加回收率结果如下表所示，最终结果以均值计算(n=5，单位为ng/mL)。

结果表明：针对36种农药在提子基质中的添加回收实验利用PC/NH2固相萃取柱要优于Carb/NH2固相萃取柱及TPC固相萃取柱，36种组分的回收率均在60%～120%，回收率在80%～120%占目标物的58.3%。所以本实验中均以 PC/NH2固相萃取柱作为水果基质的净化柱。另外，甲苯是过柱后的良好淋洗剂，可提高部分农残目标物的回收率，通过查阅文献，前处理中多数是利用乙腈-甲苯溶液（3+1）作为淋洗剂，但是淋洗液体积过多，里面的甲苯会引入更多杂质到样品中，浓缩上机后会影响结果的准确性，所以本研究考察固相萃取柱净化后，淋洗液体积对回收率的影响（即其他条件不变，淋洗液分别为6 mL、9 mL、12 mL、15 mL、18 mL、21 mL），结果表明当淋洗液为12 mL时，回收率相对较高，且大多数目标组分的均未超过 100%，所以实验中用 12 mL乙腈-甲苯溶液（3+1）分三次淋洗。

2.3 基质效应

由于在农残检测时，如果利用溶剂配制标准曲线进行直接定量，基质效应会严重影响结果的准确性，在常规色谱-质谱法的方法确证过程中，一般采用同一来源的空白样品配制系列标准样品和质控（QC）样品，以抵消基质效应对方法的精密度和结果的准确度产生的影响[14,15]。所以本研究也配制定量工作曲线溶液所使用的空白基质与检测样品一一对应，采用基质匹配标准曲线外标法定量对基质效应进行校正。无籽提汁基质加标(18.0 μg/kg)后的总离子流图如图1所示。

表2 经不同固相萃取柱净化后的添加回收率结果Table 2 The add recovery results of different solid phase extraction column after purification

图1 无籽提基质加标(18.0 μg/kg)样品在单离子检测模式下的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram in a single ion detection mode of a raisins matrix spiked (18.0 μg/kg) sample

2.4 线性范围、检出限和定量限

在GC/MS确证的实验条件下，取无籽提样品按样品制备处理后，得到空白提取液，分别配制5个不同浓度70.0 ng/mL、140.0 ng/mL、280.0 ng/mL、350.0 ng/mL、560.0 ng/mL，的混合标准基质溶液，现配现用。采用标准品的保留时间和相对离子峰度比进行定性，基质匹配外标法定量。结果如表3所示，36种目标物线性关系良好(R2＞0.99)。采用加标回收的方法确定方法检出限(LOD，S/N=3)和定量限(LOQ，S/N=10)分别为0.0001～0.0018 mg/kg和0.0002～0.0060 mg/kg，可满足实际检测的需要，符合GB2763-2016食品安全国家标准-食品中农药最大残留限量（MRLs）中规定的相关要求。

2.5 加标回收率

称取适量的空白无籽提汁样品，分别添加3.5 μg/kg、7.0 μg/kg和18.0 μg/kg的混合标准溶液，按照上述优化后的方法进行处理，并进行GC-MS分析，平行测定6次，回收率和精密度数据见表4。由下表可见，36种化合物加标回收率范围在60.6%～116.5%之间，RSD(n=6)在0.8%～9.5%之间，表明本方法重复性良好。另外，本研究还选取苹果、梨这两种基质分别添加浓度18.0 μg/kg，进行加标实验来验证本方法的适用性，以基质匹配标准曲线外标法定量，实验结果分别为：苹果基质中添加的36种化合物加标回收率范围在65.4%～109.5%之间，RSD(n=6)在2.1%～7.7%之间；梨基质中添加的36种化合物加标回收率范围在62.6%～119.7%之间，RSD(n=6)在1.2%～9.3%之间，该方法可以满足准确分析定量的要求，适用性较强，对仁果类，小型攀缘类及其他类水果也可参照执行。

表3 36种化合物线性方程、相关系数、方法检出限和定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of the 36 pesticides

注：Y：peak area of target compound；X：mass concentration of target compound；μg/L。

表4 36种化合物平均回收率与精密度Table 4 Average recoveries, relative standard deviation(RSD) of 36 kinds of compounds (n=6)

21 Endosulfan Sulfate (硫代硫酸酯) 104.9 1.9 92.8 4.7 105.3 3.2 22 p,p-DDT(p,p-滴滴涕) 95.6 1.8 82.9 3.9 60.6 3.4 23 Methoxychlor(甲氧滴滴涕) 69.2 1.3 89.4 3.4 86.2 1.9 24 Tetramethrin(胺菊酯) 62.6 1.5 78.5 3.8 87.1 2.7 25 Bifenthrin(联苯菊酯) 74.4 2.1 91.5 3.4 93.2 2.7 26 Fenpropathrin(甲氰菊酯) 104.3 2.3 86.6 4.7 92.6 3.2 27 Cyhalothrin(氯氟氰菊酯) 92.9 1.4 85.2 4.5 84.1 2.2 28 Acrinathrin(氟丙菊酯) 80.6 2.3 63.4 3.8 81.9 2.2 29 Permethrin(氯菊酯) 64.7 3.1 73.4 5.7 71.1 4.4 30 Cyfluthrin(氟氯氰菊酯) 92.1 2.2 80.1 5.0 76.8 3.0 31 Cypermethrin(氯氰菊酯) 71.0 2.1 68.8 4.6 77.9 1.3 32 Flucythrinate(氟氰戊菊酯) 87.4 3.6 77.2 6.1 80.0 3.6 33 Silafluofen(氟硅菊酯) 105.1 4.9 85.7 6.8 88.4 6.0 34 Fenvalerate(氰戊菊酯) 91.5 6.9 86.7 7.1 86.3 8.8 35 Tau-fluvalinate(氟胺氰菊酯) 89.4 5.3 82.3 8.2 73.8 9.5 36 Deltamethrin(溴氰菊酯) 101.4 1.7 79.6 4.4 76.4 4.7

2.6 实际样品分析

采用本研究建立的方法对 2017年贵州省食品风险监测委托送检的50份水果样品进行监测，在1份苹果中检出腐霉利农药，其含量为 4.05 μg/kg，未超过食品风险监测评估中的限值要求。

另外为验证本方法的准确性，此份苹果样品依据《GB 23200.8-2016 食品安全国家标准 水果和蔬菜中 500种农药及相关化学品残留量的测定气相色谱-质谱法》进行测定，最终的腐霉利结果为 4.22 μg/kg（n=5，RSD(%)为 0.83），表明本方法的准确度与国标相一致。

3 结论

本研究针对水果基质通过不同种固相萃取柱净化后的加标回收考察实验，筛选出对水果基质净化效果较好的固相萃取柱，通过优化提取液体积、提取次数及净化柱淋洗液体积等实验参数，建立了固相萃取法结合气相色谱-质谱法同时测定水果中36种农药残留量的方法，在国家标准《GB 23200.8-2016 食品安全国家标准 水果和蔬菜中500种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法》基础上，本方法将双柱依次净化优化成单柱净化，并减少了溶剂置换次数，缩短了检测时间，提高了检测效率及灵敏度，使得该方法前处理步骤简便，特异性强，回收率稳定；适合仁果类，小型攀缘类等水果基质中多组分农药残留的筛查和确证，方法的定量限也能够满足国内对农药残留的检测要求。