左旋奥拉西坦在脑缺血再灌注模型大鼠体内的药动学研究

利 玲，胡 秀，利 莉 （1.鄂东医疗集团黄石市中心医院，湖北理工学院附属医院，湖北 黄石 435000；2.肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 黄石 435000）

奥拉西坦是一种临床上用于治疗认知障碍、记忆障碍、缺血性中风和痴呆的益智药[1-2]。通过与谷氨酸受体的相互作用，奥拉西坦可以选择性作用于大脑皮层和海马，保护、激活或促进神经细胞功能的恢复，积极调节神经递质的兴奋过程，而药物本身没有直接的血管活性，也没有中枢兴奋作用，对学习记忆能力的影响是一种持久的促进作用[3-4]。此前有研究探讨奥拉西坦对实验动物和细胞的保护作用，结果显示仅有奥拉西坦的左旋体表现出活性[5-6]。在谷氨酸的存在下，左旋奥拉西坦刺激Ca2+被摄取到小脑，并呈现剂量依赖性，而右旋奥拉西坦是无效的[7-8]。尽管奥拉西坦的活性具有立体选择性，目前临床常用的仍为奥拉西坦的消旋混合物。由于机体的生物选择性和潜在的对映体相互转化，药物对映异构体可能有不同的药代动力学、毒理学和药效学特性。因此阐明奥拉西坦对映异构体中具有活性的左旋奥拉西坦在正常大鼠及脑缺血再灌注模型大鼠体内的药代动力学特性具有重要意义。

本文应用高效液相色谱法（HPLC）建立了大鼠血浆中左旋奥拉西坦浓度的测定方法，探讨左旋奥拉西坦在正常大鼠及脑缺血再灌注模型大鼠体内药代动力学规律，旨为左旋奥拉西坦的药代-药效（PK-PD）研究和临床应用的合理性及安全性提供重要参考依据。

1 材料

1.1 仪器

日立L-7000型高效液相色谱系统，配有L-7110型泵，L-7200型自动进样器，L-7420型UV检测器；Vortex-5型涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；BS110S型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；高速低温离心机（美国Thermo Scientific公司）；KQ 500DE型数控超声波清洁器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

左旋奥拉西坦（纯度＞ 99%，深圳斯坦德化工科技有限公司）；茴拉西坦（纯度＞ 98.5%，北京万佳首化生物科技有限公司）；HPLC级乙腈和HPLC级甲醇均购自美国天地高纯溶剂有限公司；水为纯净水；其余试剂均为分析纯。

1.3 实验动物

雄性SD大鼠，体质量230 ～ 270 g，购自北京维通利华动物实验中心，实验动物合格证号为SCXK（京）2014-0016。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[9-10]

色谱柱为APS-2 HYPERSIL柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），流动相为水-乙腈（12 : 88，v/v），流速为1.0 mL·min-1，检测波长214 nm，柱温25 ℃。

2.2 标准溶液的配制

精密称取左旋奥拉西坦适量，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为20 mg·L-1储备液，临用前用甲醇稀释成浓度为5、20、100、500、750、1000 µg·mL-1的标准系列溶液，同法配制质控样品的标准溶液，浓度分别为10、400、800 µg·mL-1。

精密称取内标适量，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为1000 µg·mL-1的标准溶液。

2.3 血浆样品处理

取100 µL血浆，加入10 µL内标溶液和300 µL甲醇，充分涡旋振荡，14 000 r·min-1离心10 min；将上清全部移入另一干净EP管中，采用氮气吹干仪将甲醇吹干完全，加入100 µL甲醇进行复溶，再次充分涡旋振荡，14 000 r·min-1离心10 min，取上清20 µL进样分析。

2.4 动物模型建立

本实验采用改良Zea Longa线栓法[11]制作大脑中动脉闭塞所致局灶性脑缺血再灌注大鼠模型。待大鼠麻醉后，使其仰卧并固定在手术平板上，颈部备皮并消毒；在颈部正中稍偏右切口，分离皮下和肌肉组织，使颈总动脉暴露；剥离颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）；用手术线结扎ECA，CCA的近心端，并在CCA的远心端备线用于止血，使用动脉夹夹住ICA远心端；在CCA剪一“v”形口，将尼龙线栓插入CCA内，将尼龙线栓沿ICA管腔缓慢送入颅内，直至送至大脑中动脉（MCA）的起始端，线栓入颅的长度应距离ECA和ICA的分叉处约18 mm，将止血线收紧；手术伤口采用以生理盐水浸湿的纱布覆盖，并保持在37 ℃和一定的湿度；40 min后缓慢拔出尼龙线栓，结扎止血线；皮肤缝合。

参照Zea Longa 5分制评分方法对手术后2 ～ 4 h的动物神经行为学进行评分[12]。0分：无神经功能损伤；1分：轻微神经功能缺损，不能完全伸展对侧前爪；2分：对侧前肢卷曲；3分：轻度向对侧转圈；4分：严重向对侧转圈；5分：对侧偏瘫。选取2分～ 3分的脑缺血再灌注模型大鼠于术后24 h进行实验。

2.5 药代动力学实验[13-14]

采用生理盐水将左旋奥拉西坦配制成3 mg·mL-1的溶液，并用0.22 µm的滤膜过滤，用于大鼠的尾静脉注射。12只SD大鼠随机分为两组，即正常对照组和脑缺血再灌注模型组，每组6只，两组大鼠以15 mg·kg-1的剂量尾静脉注射给予左旋奥拉西坦，于给药前及给药后2、5、15、30、45、60、90、120、240 min通过大鼠眼眦静脉取血250 µL置于肝素化EP管中，以4500 r·min-1离心15 min，分离出100 µL血浆，按“2.3”项下方法操作，进样20 µL分析。

2.6 数据处理

药代动力学参数采用DAS 2.0软件计算，两组大鼠参数的统计采用SPSS 20.0计算，组间比较采用t检验进行分析，以P ＜ 0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 分析方法的确证

3.1.1 专属性 在“2.1”色谱条件下，左旋奥拉西坦和内标的保留时间分别为5.12 min和6.19 min，空白血浆、空白血浆中加入左旋奥拉西坦和内标、大鼠给药后的血浆样品色谱图见图1，实验结果表明左旋奥拉西坦和内标的测定不受血浆中的内源性物质干扰。

3.1.2 标准曲线的制备及定量下限 分别取空白血浆90 μL，加入10 μL左旋奥拉西坦系列标准溶液，配制成相当于左旋奥拉西坦浓度为0.5、2.0、10.0、50.0、75.0、100.0 µg·mL-1的血浆样品溶液，按“2.3”项下方法操作，以左旋奥拉西坦浓度（X）为横坐标，左旋奥拉西坦和内标的峰面积比值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得相应的回归方程Y = 0.359 5 X + 2.532，r2=0.996 8，权重因子W = 1/X2。定量下限为0.5 µg·mL-1（S/N≥ 10）。质控样品的血浆样品溶液同法配制，浓度分别为1、40、80 µg·mL-1。

图1 大鼠血浆色谱图注：A -空白大鼠血浆，B -空白大鼠血浆+左旋奥拉西坦（0.5µg·mL-1）+内标，C -大鼠静注左旋奥拉西坦后1 h血浆；1 - 左旋奥拉西坦，2 - 内标Fig 1 Chromatograms of plasma in ratNote: A- blank rat plasma, B - blank rat plasma + S-oxiracetam(0.5 µg·mL-1) + internal standard, C - plasma sample 1 h after administration of S-oxiracetam to a rat; 1 - S-oxiracetam, 2 - internal standard

3.1.3 提取回收率 按“3.1.2标准曲线的制备及定量下限”项下操作配制质控血浆样品（1、40、80µg·mL-1，n = 3），按“2.3血浆样品处理”项下操作，进样分析得到左旋奥拉西坦血浆样品峰面积A。另用甲醇配制成左旋奥拉西坦的标准溶液（10、400、800 µg·mL-1），除不加入空白血浆外，其余操作同“3.1.2标准曲线的制备及定量下限”项下操作，每个浓度平行做3份，进样分析得到左旋奥拉西坦血浆样品峰面积B。左旋奥拉西坦的回收率为A/B的平均值×100%，结果三浓度质控样品的回收率分别为（97.4 ± 5.3）%、（98.3 ± 4.1）%、（96.0 ± 6.8）%，回收率均大于90%，且在待测浓度范围内，样品低、中、高浓度的回收率稳定（RSD ＜ 15%），符合生物样品分析要求。

3.1.4 精密度和准确度 实验样品为质控样品（n =6），按“2.3血浆样品处理”提取处理后进样，测定日内和日间变异，随行标准曲线计算其浓度，并与理论浓度比较计算其准确度。结果见表1，所有样品的日内RSD和日间RSD均小于15%，同时低、中、高3个浓度准确度在85% ～ 115%范围内，符合生物样品分析要求。

3.1.5 稳定性 实验样品为质控样品（n = 6），分别考察室温放置6 h、- 20 ℃冰箱冻存10 d和进样仓放置12 h的稳定性。按“2.3血浆样品处理”提取处理后进样，三种条件下的测得值和理论值无显著性差异，显示样品在上述储存条件下稳定，详见表1。

表1 精密度、准确度和稳定性结果. n = 6Tab 1 Results of precision, accuracy and stability. n = 6

3.2 药代动力学结果

在主要药动学参数中，正常对照组大鼠和脑缺血再灌注模型组大鼠的AUC0-t、AUC0-∞、MRT0-t、t1/2z、CLz和Vz具有显著性差异（P ＜ 0.05）。推断由于脑缺血再灌注模型组大鼠的病理状态导致了药物在体内的代谢速率减慢，清除率降低，平均驻留时间延长，所得的平均药-时曲线和主要药动学参数见图2和表2。

4 讨论

4.1 检测波长的确定

图 2 大鼠静注左旋奥拉西坦后的平均血药浓度-时间曲线. n = 6,Fig 2 Plasma concentration-time profile of S-oxiracetam following single intravenous administration in rats. n = 6,

表2 大鼠静注左旋奥拉西坦后的主要动力学参数. n = 6Tab 2 Pharmacokinetic parameters of S-oxiracetam following single intravenous administration in rats. n = 6,

表2 大鼠静注左旋奥拉西坦后的主要动力学参数. n = 6Tab 2 Pharmacokinetic parameters of S-oxiracetam following single intravenous administration in rats. n = 6,

注：与正常对照组比较，*P ＜ 0.05Note: compare with the normal group, *P ＜ 0.05

参数 正常对照组 模型组AUC0-t/µg·mL-1·min-1 734.5 ± 193.8 1391.3 ± 403.8*AUC0-∞/µg·mL-1·min-1 772.7 ± 199.7 1436.9 ± 410.4*MRT0-t/min 27.1 ± 12.4 50.5 ± 17.8*t1/2z /min 34.6 ± 14.5 59.7 ± 18.1*CLz /L·min-1·kg-1 0.02 ± 0.009 0.01 ± 0.004 Vz /L·kg-1 3.1 ± 1.0 0.8 ± 0.3*Cmax /µg·mL-1 38.1 ± 25.6 35.0 ± 20.1

从左旋奥拉西坦结构看出其紫外吸收较弱，通过紫外扫描发现，该化合物仅在210 nm波长处附近有较强吸收。虽考虑到210 nm与甲醇的最大截止波长205 nm比较接近，造成基线的扰动可能较大，但是为得到更高的灵敏度，通过固定相和流动相的优化，选择214 nm作为检测波长，左旋奥拉西坦和内标物的吸收度相对均较大，色谱峰尖锐、稳定，可用于定量。

4.2 内标物的选择

本研究选择左旋奥拉西坦的结构类似物茴拉西坦作为内标，该化合物稳定性良好，价廉易得，便于推广使用。在本实验的色谱条件下，内标物和被测物得到了良好的分离，提高了实验的准确度，可以用于生物样品中左旋奥拉西坦的定量检测。

4.3 前处理方法确定

本研究探索了几种血浆样品前处理的方法，包括有机溶剂直接沉淀法，液液萃取法等。直接沉淀法会对血浆样品进行稀释，大大降低了方法的灵敏度，无法成功用于大鼠体内的左旋奥拉西坦的药动学研究；由于左旋奥拉西坦化合物的极性较大，采用常规的乙酸乙酯萃取法会显著降低方法的回收率。因此，本研究采用甲醇沉淀蛋白后，吹干，再用小体积甲醇复溶的方法，简便易行，且提高了灵敏度。

4.4 色谱柱的选择

由于左旋奥拉西坦的极性较大，采用普通C18色谱柱时保留时间太短，本研究通过不断实践，采用氨基柱作为固定相，得到了合适的左旋奥拉西坦和内标物的保留时间和分离度。

4.5 临床意义

本研究首次根据左旋奥拉西坦的理化性质对色谱柱的填料类型、流动相的组成及配比、紫外检测波长等条件进行了摸索，最后采用了高效液相色谱法建立了大鼠血浆中左旋奥拉西坦的浓度测定方法，该法操作快速简便，方法稳定，适用于大鼠体内的左旋奥拉西坦药物代谢动力学研究，以及其它相关的研究。左旋奥拉西坦在大鼠体内代谢迅速，本研究采用脑缺血再灌注模型大鼠进行药代动力学研究，通过比较发现，正常组大鼠和脑缺血再灌注模型大鼠的药代动力学参数具有显著性的差异，脑缺血再灌注模型组大鼠较正常组大鼠药-时曲线下面积增加，消除速率减慢。因此该药物在临床应用于脑缺血再灌注病人时，应该注意其剂量的设计，从而保证药物在临床应用过程中的安全性和有效性。当然由于人类和大鼠的种属差异明显，左旋奥拉西坦在患者体内的药代动力学特征仍需要进一步评估。