西黄丸含药血清对大肠癌细胞干性标志物表达的影响※

孔婧妍 杨 帆

（天津中医药大学中医学院，天津 301617）

大肠癌作为一种生活中常见的癌症，给人们带来了非常严重的危害。在全球所有的癌症之中，大肠癌发病率一直居高不下，我国更是大肠癌的高发地区，在所有恶性肿瘤病死率中位居第5[1]。因此寻找能够防治大肠癌的有效药物并阐明其作用机制已成为当前研究亟待解决的问题。中医药在防治肿瘤方面具有独特的优势，已成为抗肿瘤治疗的重要组成部分。大肠癌属本虚标实的虚实夹杂病证，多与虚、瘀、痰、毒有关。中医治疗讲究辨证论治，针对有形实邪，化坚活血解毒法在癌症的治疗中显得十分重要。因此在选择活血解毒药物时，更要突出一个软坚散结的关键功能特点。西黄丸由牛黄、麝香、乳香（醋制）、没药（醋制）粉末加黄米饭以水泛丸而成，具有豁痰散结，解毒消痈之功。该方主要针对痰、瘀、毒邪，即针对大肠癌邪实的特点进行治疗，药简力专，是治疗痈疽疔毒、瘰疬、痰核、流注、癌肿之名方。在临床抗肿瘤方面，特别是在肿瘤联合用药方面发挥了重要作用[2-3]。但西黄丸抗大肠癌的具体分子机制仍需进一步明确。本实验拟通过检测肿瘤干细胞标志物CD44+／EpCAMhigh的表达情况，从肿瘤干性细胞的角度认识西黄丸抗大肠癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Wistar雄性大鼠（许可证号：SGXK(津)2014-0001）；西黄丸（天津中新药业乐仁堂制药厂生产）；人大肠癌LoVo细胞株来源于本实验保存的细胞株；1640培养基购自北京迈晨科技有限公司；胎牛血清和双抗购自Hyclone，0.25%胰蛋白酶 (含0.02%EDTA)购自 Gibco；DMSO、β-巯基乙醇购自Sigma；PBS磷酸盐缓冲液购自武汉博士德生物工程有限公司；抗体FITC anti-mouse/human CD44（103021） 和抗体PE anti-human CD326 (EpCAM)（324205） 均购自Biolegend公司。

1.2 实验方法

1.2.1 西黄丸含药血清的制备 （1）动物饲养及分组。28只雄性Wistar大鼠置于天津中医药大学动物房饲养，自由饮水进食（水和饲料均由天津中医药大学动物房提供），每只鼠笼最多饲养4只大鼠，以给予充分空间，垫料每日更换一次，室温17℃～24℃。普通饲养1周后，对大鼠进行称重分组，分为生理盐水对照组与西黄丸低、中、高剂量组，每组7只。 （2）给药方式和剂量。将西黄丸分别配制成2.16 g（kg·d）、3.24 g（kg·d）、4.32 g（kg·d） 浓度的悬浊液给予中药组大鼠灌胃，生理盐水组予生理盐水4 mL，2次/d，连续7 d；于末次灌胃前禁食不禁水12 h，末次灌胃后1 h，采用股动脉取血法，全血采集到无菌离心管内。（3）血清制备。全血于4℃静置，2 h；离心3 000 r/min，15 min，分离上清液；56℃水浴锅灭活，30 min；0.22 M微孔滤器过滤除菌，分装于1.5 mL无菌离心管中，每管1 mL，标记清楚后于-80℃冰箱保存备用。使用时用1640培养基稀释至浓度为10%使用。

1.2.2 大肠癌LoVo细胞的培养与分组 取冻存的大肠癌LoVo细胞株，于37℃水浴箱迅速融化；用含10%FBS的1640培养液稀释；离心1 000 r/min，5 min；弃掉废液，加入适量新鲜完全培养基，接种到新的培养瓶中；置37℃、5%CO2细胞培养箱培养。次日进行换液，细胞到对数生长期时传代。传2～3代后，分为空白对照组、西黄丸低剂量组、中剂量组和高剂量组，分别加入相应含浓度10%鼠血清的培养基；置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养。药物作用48 h后处理细胞。

1.2.3 流式细胞分析术检测CD44／EpCAM阳性率 去培养基，用PBS清洗细胞，0.25%的胰蛋白酶消化处理贴壁细胞，1640培养基终止消化。细胞重悬，将细胞悬液离心后弃上清液，用冰PBS重悬，调整细胞浓度为3.3×106个/mL。取流式上样管分别加入上述细胞悬液，分别加入FITC标记的CD44抗体和PE标记的EpCAM抗体，混匀后，避光染色30 min。PBS洗涤去除未结合抗体成分后，用流式细胞仪进行检测分析。重复以上试验3次，统计均数和标准差。

1.3 统计学方法 用SPSS 17.0软件。计量资料以均数标准差（x±s）描述。先对数据进行正态性检验，多组间比较单因素方差分析（one-way，ANOVA），方差齐的实验结果采用LSD-t检验方法进行各组间的比较；方差不齐的实验结果采用Dunnett-T3检验方法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

西黄丸能够降低大肠癌肿瘤细胞干性标志物CD44+／EpCAMhigh的表达百分比（图1）。与空白对照组相比，LoVo细胞在西黄丸不同剂量的作用下，CD44+/Ep-CAMhigh表达的阳性率呈降低趋势 (表1)。其中，中、高剂量组的差异有显著的统计学意义 (P＜0.05)。提示西黄丸可能对大肠癌肿瘤干细胞活性存在抑制作用。

图1 流式细胞术检测CD44+／EpCAMhigh细胞百分比

表1 LoVo细胞中不同组别CD44／EpCAM的阳性率

3 讨论

西黄丸（又名犀黄丸）载于 《外科证治全生集》，是中医药治疗癌肿之名方，方中以牛黄为君，取其清热泻火，豁痰解毒之功；以麝香为臣，取其通诸窍之不利，开经络之壅塞，活血通络之功；乳香、没药具破癥结、散瘀血之效，共为佐药，辅料黄米饭可调胃和中，以免诸药攻邪太过而伤脾胃。现代研究表明西黄丸对多种恶性肿瘤都有抑制作用[4-6]，已广泛用于恶性肿瘤的治疗，临床疗效明显。

肿瘤干细胞是肿瘤细胞群体中的一部分特殊的肿瘤细胞亚群，具有自我更新、无限增殖、多向分化等潜能，在肿瘤的侵袭及转移过程中发挥关键作用。研究发现EpCAMhigh/CD44+为大肠癌干细胞重要的表型特征。CD44分子作为一种细胞粘附分子，与多种恶性肿瘤的侵袭转移有着密切的联系[7-8]。EpCAM，又称CD326，是由GA-733-2基因编码的40 kd的糖蛋白，是最早被发现的肿瘤标志物之一[9]。EpCAM参与了信号传递、细胞迁移、增殖以及分化等过程，可在大肠癌组织中表达且有较高的检测率，因此可作为临床检测大肠癌诊断的生物标志物。

本实验选择观察大肠癌干细胞表面标记物CD44+/EpCAMhigh的表达情况，来推断西黄丸对大肠癌肿瘤细胞干性的影响。通过流式细胞术，检测西黄丸含药血清作用于人体大肠癌LoVo细胞后，CD44+／EpCAMhigh作为检测大肠癌肿瘤细胞干性指标，观察西黄丸不同剂量组与空白对照组相比，CD44和EpCAM双阳性的细胞数量占大肠癌LoVo细胞数量的比例变化。结果表明西黄丸中、高剂量组与空白对照组比较，CD44+/Ep－CAMhigh百分比有下降趋势，且差异有统计学意义。提示西黄丸对LoVo细胞的肿瘤干细胞活性可能具有抑制作用，这可能是西黄丸防治大肠癌转移的机制之一。运用现代生物技术手段探析西黄丸抗癌的作用机制，可以更好地发挥西黄丸的临床价值，促进传统中医药与现代生命科学技术相结合，为中医药的发展提供新的空间。