不同提取方式的五倍子对两种临床分离耐药菌的体外抑制作用研究※

耿少辉 程 凤 陈伟姣 李江波 王 帆 陈梦茹 杨丽萍 魏天贵 吕 越

（1 河南中医药大学第一临床医学院，河南 郑州 450046；2 河南中医药大学基础医学院，河南 郑州 450046；3 河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000；4 河南中医药大学实验动物中心，河南 郑州 450046）

耐药菌的大量产生增加了临床患者死亡的危险性[1-2]，寻求能够对抗多重耐药菌的替代抗菌药物已经成为全球关注的一个热点。多重耐药鲍曼不动杆菌与金黄色葡萄球菌是医院感染的重要病原菌。近年来其感染在增多，且耐药性日益严重[3-4]，已引起临床和微生物学者的高度关注。有研究表明五倍子具有良好的抑菌效果[5]。但体外抑菌实验大部分选用的是敏感标准菌株，有关五倍子对耐药菌抑菌作用的研究相对较少，五倍子是否对临床分离的多重耐药菌具有抑菌作用，尚有待研究。五倍子抑菌成分复杂，各成分稳定性差异较大[6]。目前常用的水煎煮、醇提取与超声提取3种提取方法因提取溶剂与提取方式的不同，是否会使五倍子提取物的抑菌效果出现差异尚不明确。本实验采用水煎煮、醇提取与超声提取三种方法制备五倍子提取物，并与具有代表性的抗生素进行对比，系统研究了五倍子对多重耐药鲍曼不动杆菌的抑制作用，期望能为临床用药剂型的选择与进一步的实验研究提供实验室依据。

1 材料和方法

1.1 实验对象 由河南中医药大学第一附属医院检验科提供的临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌与金黄色葡萄球菌。详细耐药情况见表1。

表1 临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌与金黄色葡萄球菌耐药情况

1.2 实验试剂 五倍子饮片300 g（批号：161101，购自南阳仲景百信医药科技有限公司）、无水乙醇5 L（批号：17-011-00015，购自沧州海岳化工有限公司）、牛肉蛋白胨250 g×1瓶（英国OXIOD公司）、琼脂100 g×1瓶（郑州安图生物工程有限公司）、青霉素G药敏纸片1瓶、庆大霉素药敏纸片1瓶、磺胺甲恶唑药敏纸片1瓶（天坛药物生物技术开发有限公司）。

1.3 实验仪器 电子天平1台（OHAUS公司），恒温水浴锅和医用超声波清洗机1台（上海胜卫电子科技有限公司）、一次性大号培养皿（直径150 mm）30个（郑州安图生物工程有限公司）、生物安全柜1台（上海力申科学仪器有限公司）、接种环2个（莱博生物实验耗材公司）、恒温培养箱1个（天津市泰斯特仪器有限公司）、麦氏比浊仪1台（法国梅里埃生物有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 五倍子提取物的制备 （1）水煎煮法。将五倍子饮片粉碎至过16目筛，称取50 g，置烧杯中加水浸泡1～2 h，将烧杯放于电热板，加入400 mL水煎煮30 min。趁热用8层纱布过滤，滤渣另加300 mL水煎煮20 min。趁热过滤，合并2次滤液，置旋转蒸发仪中80℃浓缩至50 mL，定容，置于高温高压灭菌锅中灭菌，即得1 g/mL的五倍子药液[7]。（2）醇提取法。水浴锅温度设置为80℃，称取五倍子粉末20 g加入圆底烧瓶中。取200 mL 80%乙醇加入圆底烧瓶，浸泡1 h后，水浴加热回流1 h，过滤。滤渣加入160 mL 80%乙醇，再次回流加热1 h。过滤，合并2次滤液；置旋转蒸发仪中80℃浓缩，定容至20 mL。高温高压灭菌，即得1 g/mL的五倍子药液[7]。（3） 超声提取法。取25 g五倍子粉末，用250 mL 80%的乙醇浸泡30 min后放入超声装置中，50℃，100%功率超声提取30 min。用八层纱布过滤取上清。残渣加入250 mL 80%的乙醇，相同条件提取30 min。过滤。合并2次滤液，置于旋转蒸发仪80℃浓缩，定容至25 mL，高温高压灭菌，即得1 g/mL的五倍子药液[7]。

1.4.2 培养基的制备 （1）液态培养基。称取牛肉蛋白胨13 g，加入1000 mL蒸馏水，加热溶解。使用1 mol/L NaOH与1 mol/L的HCl调试pH至7.6。在1.05 kg/cm2，121 ℃的条件下高温高压蒸汽灭菌20 min。将灭菌后的培养基放入37℃的恒温箱中保存24～48 h，观察是否变浑浊，检查灭菌是否彻底。（2）固态培养基。称取牛肉蛋白胨13 g，加入1000 mL蒸馏水，加热溶解。再加入25 g琼脂糖，加热溶化。使用1 mol/L NaOH与1 mol/L的HCl调试PH至7.6。相同条件下高温高压蒸汽灭菌20 min。待培养基温度冷却到50℃左右时，在超净工作台上将培养基均匀倒入无菌平板，厚度控制在4 mm。将灭菌后的培养基放入37℃的恒温箱中保存24～48 h，观察是否变浑浊，检查灭菌是否彻底。

1.4.3 菌株复苏 将检测后的细菌在固态培养基上分区划线，于37℃温箱中培养24 h。挑取单个菌落用生理盐水配置成0.5麦氏浊度（相当于108 CFU/mL）菌液。

1.4.4 制作无菌小纸片 将打孔器制成的小纸片（直径为5 mm） 放入培养皿中，高压 (表压：0.7 kg/cm2，温度：115℃，时间：30 min)灭菌，取出放凉，即得实验用的无菌小纸片。

1.4.5 体外抑菌实验 采用药敏纸片琼脂扩散法进行体外抑菌实验，使用接种环将0.5麦氏浊度菌液均匀涂布于固体培养基上。实验分为7组，即水煎组、醇提组、超声提取组、青霉素组、庆大霉素组、磺胺甲恶唑组与阴性对照组，每组均设置6个无菌小纸片，均匀放置于培养基上。用校准过的加样枪加1 g/mL中药水煎剂溶液10 μL于无菌小纸片，其余各组以同样的方法分别加入等量的醇提取剂与超声提取剂。将培养皿于37℃温箱中培养24 h，使用游标卡尺测量各抑菌环直径。

1.4.6 观测指标 抑菌环直径：用游标卡尺测量抑菌环的直径，抑菌环的判断依据参照国内同类型的实验的标准作为结果：抑菌圈直径＞20 mm为高度敏感，10～19 mm为中度敏感，＜10 mm为不敏感[8]。

1.7 统计学方法 实验数据以均值±标准差（x±s）表示，组间比较使用SPSS 21.0进行采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同提取方式的五倍子对多重耐药鲍曼不动杆菌与金黄色葡萄球菌抑制效果的比较 培养24 h后，3种提取方法的五倍子提取物对多重耐药鲍曼不动杆菌与金黄色葡萄球菌均有抑制作用，抑菌强度为中度敏感。抑菌环直径对比结果显示，不同提取方式的五倍子对多重耐药鲍曼不动杆菌与金黄色葡萄球菌抑制效果的差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 3种五倍子提取物对两种耐药菌抑制效果的比较（x±s）

2.2 不同提取方式的五倍子与3种抗生素对两种耐药菌抑制效果的比较 对于多重耐药鲍曼不动杆菌，五倍子提取物的抑菌环直径均大于青霉素G、庆大霉素、磺胺甲恶唑的抑菌环直径，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。对于多重耐药金黄色葡萄球菌，五倍子提取物抑菌效果均优于青霉素G、庆大霉素、磺胺甲恶唑，差异也具有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表3 五倍子提取物与3种抗生素对多重耐药鲍曼不动杆菌的抑制效果比较 （x±s）

表4 五倍子提取物与3种抗生素对多重耐药金黄色葡萄球菌抑制效果的比较 （x±s）

3 讨论

本研究结果发现3种常用的提取方法提取的五倍子提取物对于多重耐药鲍曼不动杆菌与金黄色葡萄球菌均具有一定的抑制作用，药敏纸片法显示抑菌效果呈中度以上敏感。磺胺甲恶唑作为抗菌药时具有抗菌谱广，抗菌作用强的特点，对葡萄球菌、大肠杆菌的抑制效果突出。青霉素G主要对革兰氏阳性菌有效。庆大霉素是常用的氨基糖苷类抗生素，主要用于革兰氏阴性菌引起的感染。本研究发现五倍子提取物对于多重耐药菌的抑菌效果与青霉素G、庆大霉素、磺胺甲恶唑相比具有明显优势。提示五倍子中含有可以抑制耐药菌的有效成分，可为进一步从五倍子中筛选抗耐药菌的有效抑菌成分提供依据。

本研究选用临床与实验室常用的3种提取方式：水煎煮、醇提取与超声提取[9]。结果显示：3种提取方式对于五倍子抑菌效果的影响差异不大，均可以提取出五倍子的有效抑菌成分。

制备过程中发现水煎煮提取浓缩后的药液较为浓稠浑浊且不易过滤，而醇提取与超声提取所获得的药液则较为清澈。出现这种差异的原因可能与溶剂的选取有关，用水提取会将淀粉、多糖等水溶性物质混入到药液中，导致药液黏稠浑浊，而采用乙醇作为溶剂时可以有效滤除水溶性杂质，提高药液的纯度。抑菌实验显示3种提取方式的提取物抑菌效果差异不大，如对药液澄清度有一定要求可以选用乙醇作为溶剂进行提取。超声提取具有时间短、操作简便的特点，本研究证明了超声提取可以使药物中的有效成分在较低温度下溶出，要求药物提取温度较低时可以选用该方法。

本研究结果显示不同提取方式的五倍子对2种耐药菌的抑菌效果差异无统计学意义，这与张莉等[10]的报道结果不一致：醇提取优于水煎煮。原因可能有以下几方面：（1）实验菌株的选择：本研究选用的为临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌与金黄色葡萄球菌，选取的临床菌具有很强的耐药性。以往的研究多为普通菌株或耐药性较弱的敏感菌株，细菌的耐药性弱，对抗菌药物更加敏感。（2）制备工艺与流程：李学林等[11]证明不同的煎煮方法对中药煎液的质量影响较大。而水煎煮、醇提取与超声提取3种常用的提取方法缺少统一的提取规范与质量标准，每个研究所选择的提取条件均存在差异，故提取条件的差异也会在一定程度上影响着药物的抑菌效果。多项研究表明五倍子中含有鞣酸，没食子酸等多种抑菌成分，对多种细菌均具有一定的抑制作用。本研究亦证明了五倍子对多重耐药鲍曼不动杆菌的抑制作用。中药由于成分复杂，作用靶点多，不易使细菌产生耐药[12]。因此需进一步开展五倍子等具有抗菌作用的中药的研究，并对五倍子的抑菌成分进行分离与检测，研究五倍子对耐药菌的作用机制，从而为临床用药与新型抗菌药物的研发提供依据与方向。