姜多糖提取方法工艺优化及分析

廖登未 黄德春 程抒劼 曹崇江 陈贵堂

(中国药科大学工学院，江苏 南京 211198)

姜(ZingiberofficinaleRosc)又称百辣云、鲜生姜、姜根等，属姜科植物，主要分布于中国四川、贵州、福建、湖北和两广等地[1]。现代工艺研究发现，姜具有抗肿瘤[2-3]、抗氧化[4-5]和抗炎止痛[6]等药理作用。此外，姜中富含多糖类物质，且姜多糖具有抗氧化[7]、消炎抑菌[8]和抗疲劳[9]等生物活性。

在多糖的提取研究中，目前多采用热水浸提法、超声波提取法、酶提取法和微波提取等[10]方法。研究表明，即使同种原料，采用不同提取方法所得的多糖，其结构、性质、单糖成分以及生物活性均有不同。比如，Zhang等[11]在生姜多糖的研究中，采用了酸式、中性以及碱式水提法，发现3种不同的提取方法得到的生姜多糖具有不同的抗氧化活性；韩冬屏等[12]研究显示超声波辅助提取法所得姜多糖得率和DPPH·的清除能力均优于微波辅助提取和传统热水提取法的；在生姜粗、精多糖抗氧化试验中，王芸等[13]采用了水提法、超声辅助酶解法以及酶解法，得出生姜粗多糖的还原能力大小关系为：超声辅助酶解法>酶解法>水提法，而精多糖仅对DPPH·具有显著影响。

透射电镜具有分辨率高、放大倍数高、信息立体化等优势，近年来备受科研工作者的青睐。在不同方法提取姜多糖研究中，目前尚未有文献报道利用透射电镜观察姜渣细胞破损情况，分析影响姜多糖得率的试验研究。因此，本研究拟采用热水浸提法、超声波冰浴提取法、复合酶提取法3种方法对姜多糖进行分离提取，利用透射电镜和紫外-可见光分光光度计对姜渣和姜多糖进行扫描分析，对比不同提取方法对姜多糖提取效果的影响，拟为进一步深入研究不同方法所得姜多糖的结构、物化特性以及生物学活性提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干姜片：产自云南，亳州市常富药业有限公司，采用50 ℃ 减压干燥，粉碎过筛60目备用；

纤维素酶(1 800 U/mg)、果胶酶(1 000 U/mg)：上海金穗生物科技有限公司；

木瓜蛋白酶：3 U/mg，阿拉丁试剂(上海)有限公司；

其它试剂均为国产分析纯试剂；

摇摆式高速中药粉碎机：DFY-500型，温岭市林大机械有限公司；

紫外—可见分光光度计：TU-1901型，北京普析通用仪器有限责任公司；

离心机：LXJ-IIB型，上海安亭科学仪器厂；

超声波细胞粉碎机：JY-92IIN型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

真空冷冻干燥机：PD-1C-50型，北京博医康实验仪器有限公司；

分析天平：ATX224型，日本岛津仪器公司；

旋转蒸发器：RE-5205型，上海亚荣生化仪器厂；

透射电镜：HT7700型，日本日立公司。

1.2 试验方法

1.2.1 提取工艺流程

姜粉→提取(热水浸提、超声波冰浴提取、复合酶酶解)→离心(4 000 r/min，20 min)→过滤，取滤液，50 ℃旋蒸至原滤液1/4→sevag试剂(正丁醇与氯仿体积比4∶1)除蛋白→加入4倍体积无水乙醇静置→离心(4 000 r/min，10 min)，得沉淀→丙酮、无水乙醇、乙醚各洗涤2次→减压干燥，40 ℃→多糖成品

1.2.2 热水浸提法

(1) 单因素试验：探究热水浸提时间、温度、液料比对姜多糖提取率的影响。固定提取时间2 h，提取温度70 ℃，设置液料比分别为10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1(mL/g)；固定提取时间2 h，液料比20∶1 (mL/g)，设置提取温度分别为50，60，70，80，90，100 ℃；固定提取温度90 ℃，液料比20∶1 (mL/g)，设置提取时间分别为1，2，3，4，5，6 h。

(2) 正交试验设计：在单因素试验的基础上，以多糖提取率为考察对象，采用正交试验分析，优化姜多糖最优提取工艺参数。

1.2.3 超声波冰浴提取法

(1) 单因素试验：探究超声时间、功率、液料比对姜多糖提取率的影响。固定液料比20∶1 (mL/g)，超声功率200 W，设定超声时间分别为20，25，30，35，40，45 min；固定液料比20∶1 (mL/g)，超声时间35 min，设定超声功率分别为100，200，300，400，500，600 W；固定超声时间35 min，超声功率500 W，设定液料比分别为10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1 (mL/g)。

(2) 正交试验设计：在单因素试验的基础上，以多糖提取率为检测指标，采用正交试验分析，优化姜多糖最优提取工艺参数。

1.2.4 复合酶解法

(1) 单因素试验：在纤维素酶用量63 000 U/g·底物，果胶酶用量20 000 U/g·底物，木瓜蛋白酶用量62.5 U/g·底物条件下，探究酶解条件对姜多糖提取效果的影响。固定酶解时间2 h，酶解温度50 ℃，pH 5.0，设定液料比分别为15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1，40∶1 (mL/g)；在酶解时间2 h，酶解温度50 ℃，液料比25∶1 (mL/g)条件下，设定pH分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0；固定酶解时间2 h，液料比25∶1 (mL/g)，pH 6.0，设定酶解温度分别为30，40，50，60，70，80 ℃；固定液料比25∶1 (mL/g)，pH 6.0，酶解温度50 ℃，设定酶解时间分别为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h。

(2) 正交试验设计：在单因素试验的基础上，以多糖提取率为考察对象，采用正交试验分析，优化姜多糖最优提取工艺参数。

1.2.5 多糖及蛋白含量测定 根据文献[14]，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，考马斯亮蓝法测定蛋白含量，并对计算方法进行如下修改：

(1) 多糖提取率：按式(1)计算。

(1)

式中：

R1——多糖提取率，%；

c1——提取液中多糖浓度，g/mL；

V——提取液体积，mL；

m——原料质量，g。

(2) 多糖得率：按式(2)计算。

(2)

式中：

R2——多糖得率，%；

m1——多糖成品质量，g；

m——原料质量，g。

(3) 蛋白含量：按式(3)计算。

(3)

式中：

R3——蛋白含量，%；

c2——提取液中蛋白浓度，g/mL；

V——提取液体积，mL；

m——原料质量，g。

1.2.6 多糖紫外光谱扫描 将样品配成1.0 mg/mL的多糖溶液，在波长200～360 nm内进行光谱扫描，检测260，280 nm 处是否有核酸和蛋白质的特征吸收峰[13]。

1.2.7 姜渣透射电镜观察 收集经3种不同方法提取后的姜提取残渣，冻干，精确称量10.0 mg冻干粉和100 mL无水乙醇均匀混合。选用300目的高质量铜网，用镊子小心取出铜网，将膜面朝上，并轻放于滤纸上，用移液枪取20 μL待测液滴于铜网上，待其自然风干。采用透射电镜，在100 kV加速电压，线分辨率0.14 nm条件下观察细胞壁破碎情况。

2 结果与分析

2.1 热水浸提法

2.1.1 热水浸提法正交试验因素水平设计 考察液料比、提取温度、提取时间对姜多糖提取的影响，根据单因素试验结果，建立三因素三水平正交试验因素水平，见表1。

表1 热水浸提法正交试验因素设计水平表Table 1 Hot water extraction orthogonal test factor design levelTable

2.1.2 正交试验结果及方差分析 热水浸提法提取姜多糖的正交试验结果见表2。通过分析可知，影响姜多糖提取率主次因素依次为B>A>C，最优水平组合为A2B3C3，即液料比20∶1 (mL/g)，提取温度100 ℃，提取时间4 h。由表3可知，液料比、温度、时间均对姜多糖的提取有显著性影响(P<0.05)，且温度具有极显著性影响(P<0.01)，3个因素影响大小顺序与正交试验结果相符。在最优试验条件下进行3组平行实验验证，姜多糖的提取率为(11.74±0.23)%，高于正交试验中9个试验组，可见，该正交试验结果可靠。

表2热水浸提法提取姜多糖正交试验结果分析

Table 2 Orthogonal experimental results analysis ofZingiberofficinaleRosc polysaccharides extraction with hot water extraction (n=3)

序号ABC提取率/%11115.79±0.0221226.94±0.0831339.44±0.0142127.51±0.0352238.79±0.0262319.55±0.0673137.97±0.0083217.31±0.10933210.28±0.04K122.1721.2722.65K 225.8523.0424.73K 325.5629.2726.20R3.688.003.55

表3 热水浸提法正交试验方差分析表†Table 3 Analysis of variance of orthogonal test for hot water extraction

2.2 超声波冰浴提取法

2.2.1 超声波冰浴提取法正交试验因素水平设计 考察超声时间、超声功率和液料比对姜多糖提取的影响，根据单因素试验结果，建立三因素三水平正交试验因素水平，见表4。

表4超声波冰浴提取法正交试验因素设计水平表

Table 4 Ultrasonic ice bath extraction orthogonal test factor design level
Table

水平A 超声时间/minB 超声功率/WC 液料比(mL/g)13040015︰123550020︰134060025︰1

2.2.2 正交试验结果及方差分析 超声波冰浴提取法提取姜多糖的正交试验结果见表5。通过分析可知，影响超声提取姜多糖的工艺顺序：C>B>A，且最佳提取工艺条件为A1B2C3，即超声时间30 min、超声功率500 W、液料比25∶1 (mL/g)。由表6可知，超声时间，超声功率以及液料比均对姜多糖的提取有显著性影响(P<0.05)，且3个因素影响大小顺序与正交试验结果相符。对最优试验条件进行3组平行实验验证，此时姜多糖的提取率为(7.00±0.04)%，高于正交试验中9个试验组，表明正交试验方案设计稳定。

2.3 复合酶提取法

2.3.1 复合酶酶解条件正交试验因素水平设计 考察液料比、pH值、酶解温度和酶解时间对姜多糖提取的影响，根据单因素试验结果，建立四因素三水平正交试验因素水平，见表7。

2.3.2 正交试验结果及方差分析 由表8可知，影响复合酶提取姜多糖的工艺顺序为C>B>A>D，且最优提取工艺为A1B2C2D3，即液料比25∶1 (mL/g)、酶解时间2.0 h、酶解温度40 ℃和pH值7.0。由表9可知，温度、时间、液料比和pH值均对多糖提取率有极显著性影响(P<0.01)。在最优工艺条件下进行3组平行实验进行验证，提取液中姜多糖的提取率为(20.93±0.20)%，结果远高于9个正交试验组结果，可见该正交试验结果可靠。

2.4 多糖得率、纯度及蛋白质含量

3种方法提取姜多糖的多糖得率、纯度及蛋白质含量见表10。由表10可知，复合酶解法得到的姜多糖得率远高于热水浸提法和超声波冰浴提取法的；而在纯度方面，热水浸提法相对优于超声波冰浴提取法和复合酶解法。

2.5 多糖紫外光谱扫描

对3种不同提取方法得到的姜多糖进行紫外光谱扫描，如图1所示，采用Sevag法除蛋白后，姜多糖溶液在260，280 nm 处均未出现明显的特征吸收峰，从而进一步证明sevag法能有效去除姜多糖中的蛋白。

表5超声波冰浴提取法提取姜多糖正交试验设计与结果分析

Table 5 Ultrasonic ice bath extraction extraction ofZingiberofficinaleRosc polysaccharides orthogonal test design and results analysis (n=3)

序号ABC提取率/%11115.54±0.0521226.36±0.0431336.29±0.0142126.08±0.0552236.57±0.0862315.32±0.0173135.87±0.0083215.46±0.0793325.56±0.01K 118.1917.4916.32K 217.9718.3918.00K 316.8917.1718.73R1.300.902.41

表6 超声波冰浴提取法正交试验方差分析表†Table 6 Ultrasonic ice bath extraction orthogonal test analysis of varianceTable

表7复合酶酶条件正交试验因素设计水平表

Table 7 Multi-enzymatic enzyme conditions orthogonal test factor design level
Table

水平A 液料比(mL/g)B pH值C 酶解温度/℃D 酶解时间/h120︰15.0401.5225︰16.0502.0330︰17.0602.5

2.6 透射电镜扫描

对比分析不同方法提取多糖剩余姜渣的透射电镜图(图2)可知，结合姜渣透射电镜图，发现经过热水浸提后，姜细胞出现了较明显的破损，有利于姜多糖溶出；复合酶解在破坏细胞壁结构后，改变了细胞通透性，使得细胞中其他水溶性物质和多糖一同溶出，从而降低了多糖纯度；超声波提取的原理是利用超声空化，使多糖更易溶于溶剂，而试验中利用超声波提取的姜多糖得率和纯度较另2种方法低，其原因主要是采用了冰浴提取法，降低了超声波对细胞的破坏，且低温不利于姜多糖溶出[15]，其他水溶性物质，如姜酚等在低温环境中溶解度高于多糖[16]，而低温能减少多糖生物活性损失。

表8复合酶酶解提取姜多糖正交试验设计与结果分析

Table 8 Orthogonal experimental design and results analysis of extractingZingiberofficinaleRosc polysaccharides by complex enzymatic hydrolysis (n=3)

序号ABC温度D时间提取率/%1111115.69±0.022122218.80±0.083133318.02±0.124212317.02±0.115223117.71±0.096231215.21±0.037313216.08±0.068321316.84±0.159332116.60±0.01K152.5148.7947.7450.00K249.9453.3552.4250.09K349.5249.8351.8251.88R2.994.564.681.79

表9 复合酶酶解法正交试验方差分析表†Table 9 Complex enzymatic method orthogonal test variance analysisTable

表10 多糖得率、纯度及蛋白质含量Table 10 Polysaccharides yield, purity and protein content (n=3) %

图1 多糖紫外光谱扫描结果Figure 1 UV spectral scanning results of polysaccharides

图2 不同方法提取多糖剩余姜渣透射电镜扫描结果图

Figure 2 TEM scanning results of residualZingiberofficinaleRosc residue extracted by different methods

3 结论

本试验利用透射电镜扫描姜渣，试验结果表明，不同提取方法对姜细胞的破坏有明显的差异性，从而造成多糖的溶出不同。对比分析3种不同工艺提取的姜多糖，得出复合酶解法姜多糖得率最高，为(14.67±0.32)%；而在多糖纯度方面，热水浸提法相对另外2种提取方法更好，可达(86.53±0.20)%。经过sevag法除蛋白后，3种姜多糖中蛋白含量均低于0.5%，远低于文献[12]报道。

本试验中采用超声波冰浴提取法，姜多糖得率较低，且杂质较多。近年来超声波与酶解法协同提取法[17]得到广泛关注，后续可利用超声波-酶解协同提取姜多糖，同时对比分析2种提取方法在得率、纯度以及生物活性等方面的差异。