hTERC基因在子宫内膜组织中表达及临床意义*

符丽华，栾 峰，米贤军，罗小婉，高子轩，陈 昂，代新珍

广东省中山市博爱医院 (中山 528402)

主题词 子宫内膜肿瘤 子宫内膜增生 基因表达调控, 肿瘤 @人类染色体端粒酶基因

子宫内膜病变是普遍的妇科疾病,而内膜癌是妇科较常见的恶性肿瘤，严重威胁女性健康，但目前国内外对子宫内膜早期病变甚至在癌症预后判断尚没有较明确方法手段。研究表明恶性肿瘤的发生发展与基因调控失常，细胞异常增殖有关，人类染色体端粒酶RNA(Human telomerase gene,hTERC)由Feng等[1]于1995年首次从肾癌293细胞系cDNA文库中筛选出，hTERC基因的突变可导致端粒酶活性降低和端粒缩短，端粒酶基因扩增是癌变的常见现象，研究发现端粒酶异常与宫颈癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤的发生发展有关，但在子宫内膜癌研究不多。本文研究hTERC在子宫内膜组织的表达情况，探讨hTERC在子宫内膜病变发生发展中的意义，为临床探索子宫内膜癌早期诊断和预后提供依据。

对象与方法

1 研究对象 收集2015年至2016年南方医科大学附属中山博爱医院病理科正常子宫内膜、子宫内膜增生症(单纯型增生、复杂型增生、不典型增生)及子宫内膜癌组织石蜡切片各25例，共125例标本行hTERC基因FISH检测。正常子宫内膜组织年龄23～53岁，平均37.3岁；单纯型增生组年龄38～55岁，平均45.92岁；复杂型增生组年龄27～57岁，平均41.16岁；不典型增生组年龄35～63岁，平均48.76岁。子宫内膜癌手术病理分期(FIGO，2009年)标准：I期18例,II期2例,III期3例,IV期2例；高分化腺癌9例，中分化腺癌8例，低分化腺癌8例，患者年龄29～67岁，平均51.04岁。所有病例术前未接受任何治疗，临床病历资料完整。

2 研究方法

2.1 病理组织制片。①标本制作：手术或诊刮的子宫内膜组织标本常规固定石蜡包埋，切片HE染色，恶性肿瘤加做免疫组化确诊；②诊断标准：参照2010年WHO女性生殖系统组织学分类诊断标准，取典型病灶的子宫内膜石蜡包埋组织标本切片2 μm共3张组织玻片，70℃过夜烘烤，备做FISH检验。

2.2 FISH检测[2]。①北京金菩嘉医疗科技有限公司提供GLP TERC/CSP3 DNA探针、CSP3对照探针，标记颜色,绿/红。②标本预处理：脱蜡：室温将玻片置于二甲苯10 min脱蜡2次后浸入100%乙醇5 min；复水：将玻片各2 min依次浸入100%、85%和70%的乙醇后浸入去离子水中3 min后灭菌纯化水90℃水浴20～30 min。松解、消化：将组织切片浸泡在0.2 ml蛋白酶K储存液(20mg/ml)溶于40ml 2×SSC(pH 7.0)得到蛋白酶K工作液(100 μg/ml)中37℃孵育5～30 min。消化后于2×SSC溶液每次5 min漂洗2次,甲醛固定液中固定10 min后将玻片依次置于70%、85%和100%乙醇中各脱水2 min，自然干燥玻片。③FISH操作步骤：杂交液震荡混匀，离心后杂交：将10 μl 探针混合物滴在玻片杂交区，盖盖玻片后封边。将玻片放在杂交仪上83℃变性5 min，42℃复性16 h。洗涤：取出玻片移去盖玻片, 玻片放入47℃ 2×SSC中洗涤10 min，放入47℃0.1%NP-40/2×SSC洗涤5 min，浸泡在70%乙醇中脱水3 min，自然干燥玻片；观察：滴加15 μl DAPI复染剂到载玻片的组织中, 盖上盖玻片后在荧光显微镜滤光片下进行观察。75%以上癌细胞核中都有杂交信号为满意标本，在100×物镜下观察癌细胞核的FISH结果并进行信号计数和比值计算。所有完成杂交的玻片置于-20℃避光储存。

2.3 FISH结果判断。对照探针CSP3 DNA杂交到3号染色体着丝粒3p11.1-q11.1，绿色荧光信号，检测探针TERC杂交到3号染色体3q26.3位点，红色荧光信号。经过FISH图像分析软件分析OLYMPUS BX51荧光显微镜在DAPI/FIFC/TexasRed三色滤光镜激发下，细胞hTERC基因探针在3号染色体着丝粒杂交情况，观察GLP TERC/CSP3基因双色杂交结果。计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞，每例样本随机计数100个细胞，计算显示异常信号细胞数所占计数细胞的百分比。杂交结果标记颜色绿：红；正常信号细胞为绿色及红色信号各2个，即2:2；扩增异常信号细胞为绿色信号≥2个，红色信号>2个，统计TERC红色信号≥3个信号点的百分比。

2.4 阈值建立。通过FISH检测20例正常子宫内膜石蜡包埋组织切片hTERC基因表达情况，分析100个子宫内膜细胞，计算异常hTERC基因信号百分比，按平均数+3×标准差算出阈值，通过计算阈值=5.91%，即异常细胞数/计数细胞总数≥6 则判断为hTERC基因有扩增，结果为阳性。

3 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计学软件统计分析，率的比较用卡方检验或Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

子宫内膜正常组、子宫内膜单纯型增生组、子宫内膜复杂型增生组、子宫内膜不典型增生组及子宫内膜癌组织中hTERC基因阳性表达率分别为20% (5/25)、52% (13/25)、28% (7/25)、20% (5/25)、36 % (9/25 )，子宫内膜单纯性增生阳性率高于正常组和不典型增生组,差异有统计学有意义(χ2=5.5556,P=0.0184),见表1。子宫内膜癌组阳性率高于子宫内膜正常组，但经检验两组hTERC基因扩增阳性率没有统计学差异(χ2=1.5873,P=0.2077) 。按子宫内膜癌临床分期，I / II期hTERC基因阳性率为40% (8/20 )、III /IV期20% (1/4 )，虽然统计学差别没有意义(P=0.6206),但临床观察hTERC基因在早期临床期别有高阳性扩增。按子宫内膜样腺癌细胞分化程度，高分化hTERC基因阳性率22.22% (2/9)、中分化50% (4/8)、低分化37.5% (3/8),TERC基因随着腺癌分化程度越差扩增阳性率增高，但经Fisher检验没有统计学差异(P=0.5165)。本研究通过FISH检测子宫内膜组织hTERC基因表达情况得出，子宫内膜单纯性增生阳性率最高，子宫内膜癌患者较正常子宫内膜组织hTERC基因有扩增并随着癌细胞分化程度越低hTERC基因阳性扩增增加，表示子宫内膜恶性病变可能与hTERC表达异常相关。

表1 hTERC基因与子宫内膜病变的关系[例(%)]

讨 论

端粒是维护真核细胞染色体稳定性，细胞通过端粒酶合成端粒弥补染色体消耗的端粒，而端粒酶相关基因突变导致端粒酶活性下降端粒缩短，将引起细胞凋亡甚至恶变。研究表明一些肿瘤细胞出现端粒酶基因扩增是癌细胞增殖重要原因， hTERC基因扩增对端粒酶激活和癌变进展有促进作用[3]。在人类85%～90% 的癌细胞中出现端粒酶基因的激活[3]，端粒酶的激活是细胞恶化过程中的其中一个关键步骤，而端粒酶重要组成部分是位于 3号染色体长臂的人类染色体端粒酶RNA(hTERC)基因，hTERC基因的突变可导致端粒酶活性降低和端粒缩短，hTERC基因扩增与肿瘤的预后不良相关[4-5]。国内外对hTERC与妇科肿瘤方面的相关研究多见于宫颈癌[6-10]，认为宫颈癌变与hTERC基因扩增相关，在子宫内膜癌中探讨极少。对子宫内膜癌研究较多的是ER、PR、Ki67、CA125等表达[11-12]，认为ER、PR、Ki67、CA125表达上调与子宫内膜组织癌变、手术病理分期、组织分级、肌层浸润深度、淋巴结转移有关。段清等[13]研究在子宫内膜癌变过程中，hTERCmRNA表达上调、ASPP2 mRNA表达下调或缺失，二者有助于子宫内膜癌的早期诊断和预后判断。但目前国内外文献对子宫内膜早期病变至癌变过程，hTERC基因如何变化，可否预测早期内膜病变研究较少，基于此，本研究通过FISH技术检测子宫内膜组织的hTERC基因表达情况，得出在子宫内膜异常增生早期、内膜癌症和肿瘤细胞分化不良时hTERC有升高趋势，hTERC的扩增预示子宫内膜有发生异常增生和癌变的倾向。在观察随访所有患者，发现1例正常内膜组织hTERC基因信号百分比高的患者，3个月后再次诊刮发展成单纯性增生，而1例hTERC基因阳性的患者3个月后再次诊刮仍为复杂性增生，而其它非手术治疗hTERC基因阴性的患者复诊正常，这提示hTERC基因扩增预测子宫内膜病变的高风险，预后不良。hTERC基因在子宫内膜癌发生发展起重要作用，为子宫内膜病变患者提供更好的诊治方案及病情监控，有助于子宫内膜病变的早期诊断和预后判断，有助于监测患者病情及治疗方案。