豚鼠精囊Cajal间质细胞的鉴定*

王江平，王勤章，焦 勇，许志斌△

1.空军军医大学唐都医院泌尿外科(西安 710038)，2.石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科(石河子 832000)

主题词 Cajal间质细胞 精囊 受体蛋白质酪氨酸激酶 神经 肌细胞,平滑肌 细胞结构

西班牙神经解剖学家Cajal于1911年首次发现了一种特殊类型的胃肠道间质细胞，后来这种细胞被命名为Cajal间质细胞(Interstitial cells of cajal，ICC)。ICC逐渐被证实为胃肠道平滑肌自主收缩的起搏细胞，并作为“中转站”介导自主神经信号至平滑肌，调控平滑肌活动[1-2]。近二十年来，在膀胱、前列腺和尿道等组织陆续发现了ICC，研究发现这些ICC也发挥类似消化道ICC的作用，在相应组织平滑肌的活动中发挥重要作用[3-6]。精囊是男性生殖系统的重要腺体，精囊平滑肌可以自主收缩并接受神经信号的调控，参与射精等功能。精囊平滑肌的这些生理特征与消化和泌尿系统平滑肌非常相似，同时由于生殖系统和泌尿系统都起源于胚胎的中胚层，所以在精囊中很可能存在ICC。消化和泌尿系统ICC都表达特异的标记性抗原—酪氨酸激酶受体c-Kit，并具有典型的超微结构特征。本研究利用免疫荧光染色和透射电镜首次发现在豚鼠精囊腺中存在ICC，现报告如下。

材料与方法

1 材 料 体重350～500 g的成年雄性豚鼠5只。大鼠抗小鼠c-Kit抗体(1∶200)，购自美国Millipore；兔抗小鼠α-actin抗体(1∶400)，购自美国Abcam；兔抗小鼠神经元特异性烯醇化酶 (Neuron-specific enolase，NSE)抗体(1∶200)，购自美国Santa Cruz；FITC 标记的羊抗大鼠抗体(1∶200)，购自北京中杉金桥；TRITC标记的羊抗兔抗体(1∶200)，购自北京中杉金桥。

2 方 法

2.1 免疫荧光染色实验：腹腔内注射50 mg/kg 戊巴比妥钠将雄性豚鼠麻醉后处死，立即解剖、取出精囊组织；使用OCT将精囊组织包埋，冰冻切片机制作20 μm切片，贴附于载玻片上，在4℃丙酮中浸泡15 min；用1∶100胎牛血清封闭，孵育80 min，分别滴加c-Kit抗体和α-actin抗体混合液，c-Kit抗体和NSE抗体混合液，在4℃环境中孵育12 h；加FITC和TRITC标记的二抗，置于25℃湿盒内避光孵育60 min；封片后置于激光共聚焦显微镜下观察，FITC激发波长为488 nm，TRITC为543 nm，使用Zeiss LSM 软件保存、分析图片。

2.2 透射电镜观察实验：修整精囊组织边缘，切割成约2 mm3大小的组织块；置于3%戊二醛固定液中持续固定48 h，将固定后的组织块置入0.1%锇酸中固定2 h后移至1%的醋酸铀内，室温下染色2 h；将组织块脱水后浸泡在丙酮、中性树胶的混合液中，37℃烘箱内过夜；在超薄切片机上沿标本水平面切割制作2 μm的组织切片，使用甲苯蓝染色，置于显微镜下进行定位；在超薄切片机上切割100 nm的超薄组织切片，进行双重电子染色，饱和醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色15 min；将切片置于透射电镜下观察并拍片。

结 果

1 免疫荧光染色实验结果 在豚鼠精囊内发现大量的c-Kit 阳性细胞(图 1)，按照组织分布可以分为两种，一种位于精囊壁肌层的平滑肌细胞之间，另一种分布于精囊腔内蜂窝状黏膜褶皱的间质中(图 1A，1B，1C)。这些c-Kit阳性细胞和胃肠道ICC的一般形态学特征相似，细胞呈纺锤形(图 2A，2B)或星形(图 2C)，胞体约20μm，细胞两端有明显细长的突起，细胞浆染色，少量细胞浆包绕在细胞核周围，细胞核大，呈椭圆形，位于细胞中央，占细胞2/3以上体积且未被c-Kit抗体标记、染色(图 2A，2B)。ICC肌动蛋白染色阴性(图 2A)，总是与平滑肌组织内的神经纤维平行分布并密切接触(图 2C，2D)，并且精囊壁ICC与平滑肌细胞也密切接触(图 2A)。

A，B，C：c-Kit阳性ICC(绿色，黄色箭头)位于平滑肌束(红色)内；c-Kit阳性ICC(绿色，白色箭头)位于精囊黏膜褶皱间质内

图1 豚鼠精囊组织内c-Kit阳性ICC的分布

A: 免疫荧光双染显示c-Kit阳性ICC(绿色)和α-actin阳性平滑肌细胞紧密相邻(白色箭头)。B: 高倍镜下的c-Kit阳性ICC(绿色)。C，D： 免疫荧光双染显示c-Kit阳性ICC(绿色)和 NSE阳性神经纤维紧密接触(白色箭头)

图2 豚鼠精囊内ICC与神经纤维及平滑肌细胞之间的关系

2 透射电镜实验结果 透射电镜下发现豚鼠精囊壁平滑肌细胞间和囊腔黏膜皱襞间质内存在大量类似于胃肠道ICC的特殊间质细胞，梭型或星形，细胞核呈椭圆形，体积较大，染色质边聚，少量胞浆围绕细胞核分布(图 3A)，胞浆内见较多的线粒体、粗面内质网，细胞内无肌纤维，细胞膜周围可见不连续的基膜(图 3B)，少量膜陷小穴(caveolae)沿细胞膜排列(图 3A)，胞体常形成2个或多个细长的细胞突起，ICC之间可以通过细胞突起相互连接(图 3A)，上述超微结构特点符合ICC的超微结构鉴定标准。精囊壁及黏膜皱褶间质内无髓鞘神经纤维轮廓内可见神经丝以及少量线粒体(图 3A)。精囊ICC与相邻的神经末梢形成密切的接触，ICC伸出细长的突起并延伸至平滑肌细胞之间，和平滑肌细胞紧密相邻(图 3A)。

A：精囊ICC位于平滑肌细胞(SMC)之间，和神经纤维(白色箭头)密切接触，ICC通过细胞膜与临近另一个ICC(白色三角)的细胞突起密切接触，其另外一端细长的细胞突起深入平滑肌细胞之间。 ICC细胞膜上可见少量的膜陷小泡(黑色箭头)。 B：高倍镜视野可见ICC胞浆内含有大量粗面内质网(黑色箭头)和线粒体(白色箭头)

图3 豚鼠精囊ICC的超微结构

讨 论

以往消化道ICC的发现，对研究胃肠道平滑肌自主及神经调控活动具有里程碑式的意义。虽然后来在胃肠道以外的许多组织也被证实存在ICC并发挥重要的生理功能，但在精囊腺中尚未见发现ICC的报道。

c-Kit为一种受体性酪氨酸蛋白激酶，表达于ICC细胞膜上和细胞浆内，与干细胞刺激因子结合后通过不同途径引起ICC增生和分化并和ICC多种生理功能相关。c-Kit是ICC上一种特异性的抗原，为鉴定各系统ICC提供了一种可靠的工具，目前采用c-Kit抗体标记的免疫化学法已经成为鉴定ICC的“金标准”[4-7]。通常认为只要c-Kit阳性细胞为梭型或星形，具有两个或多个细胞突起，和神经纤维及平滑肌细胞联系紧密，那么这些c-Kit阳性细胞就可被认定为ICC[4-7]。本研究使用c-Kit抗体在豚鼠精囊组织内标记出大量的c-Kit阳性细胞，并且这些细胞符合ICC的上述一般形态特征，和神经纤维及平滑肌细胞联系紧密，所以我们将这些c-Kit阳性细胞认定为精囊ICC。另外，尽管肥大细胞也可以表达少量的c-Kit，但是其呈典型的圆形，没有明显的细胞突起，且细胞体积较大，明显区别于这些精囊ICC。

在使用c-Kit抗体标记的免疫组化法成为鉴定ICC的“金标准”之前，透射电镜下细胞超微结构观察是鉴定ICC的首选方法[8]。目前确认ICC的超微结构特点有：细胞呈典型的梭型或星形，胞体约20 μm大小，细胞核呈椭圆形，占细胞的2/3以上，大量线粒体，大量粗面内质网，膜陷小穴，不完整的细胞基膜，细胞内不含肌动蛋白等[7]。本实验通过透射电镜观察发现在豚鼠精囊壁平滑肌细胞之间和精囊腔黏膜皱褶的间质内存在一种特殊的间质细胞，这些细胞具有上述ICC的超微结构特点，和组织免疫荧光染色标记的c-Kit阳性细胞解剖定位、一般形态及细胞核浆比例等形态学特点高度一致，并且也和神经纤维及周围的平滑肌细胞关系密切，所以我们结合两种观察结果确定这些特殊的间质细胞为精囊ICC。

胃肠道ICC为平滑肌慢波的起搏细胞，控制着胃肠道活动的基本节律，同时作为“中转站”，介导胃肠道神经信号，调控平滑肌活动[1-2]。ICC发挥上述功能的结构基础就是ICC和神经、平滑肌细胞具有密切的形态学联系。本研究通过免疫荧光染色及透射电镜发现豚鼠精囊ICC和神经纤维以及平滑肌细胞之间联系紧密，电镜下观察到相邻的精囊ICC常借助突起互相连接，这些细长的突起还延伸入平滑肌细胞之间，所以我们初步推测精囊ICC和平滑肌活动密切相关，可能像胃肠道及膀胱、前列腺ICC一样充当精囊平滑肌自主活动的起搏器以及神经信号调控平滑肌活动的“中转站”，参与精囊射精等活动。肠道、膀胱ICC还具有感受张力刺激的作用，在张力作用下ICC产生起搏信号或者将张力信号上传。正常性欲的维持与精囊内的张力有关[9-10]，在精囊蜂窝状黏膜皱褶内中几乎没有平滑肌细胞存在，黏膜皱褶间质中的 ICC和神经元纤维联系紧密，我们推测其可能通过某种机制感受精囊腔内张力刺激并转化为神经信号上传，从而参与雄性性欲的产生和维持。

综上所述，我们通过免疫荧光标记和透射电镜首次在豚鼠精囊壁平滑肌细胞间及精囊腔黏膜皱褶间质内发现大量的特殊间质细胞，这些细胞表达ICC特异性抗原c-Kit，符合ICC超微结构特征，和神经纤维及平滑肌细胞关系密切，可能发挥着类似ICC的生理作用。