四川省鼠疫耶尔森菌CRISPR基因分型及地区分布研究

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1997年发现四川省第一块鼠疫自然疫源地暨石渠县青海田鼠鼠疫疫源地，到2007年发现德格县喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地，2011年发现巴塘县喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地，2012年发现理塘县喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地，2014年发现雅江县喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地，2015年发现新龙县喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地，至今四川已有2类6块鼠疫自然疫源地[1-7],共分离百余株鼠疫菌，主要分为青藏高原青海田鼠型鼠疫菌和青藏高原喜马拉雅旱獭型鼠疫菌。

规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)是一个在细菌中的DNA序列家庭，序列包含能攻击细菌的病毒DNA片段，在细菌遭到病毒攻击时，使用这些片段可以检测和破坏来自相似的病毒DNA，这也是细菌对病毒的防御及免疫策略。这些序列在细菌的防御系统中发挥着关键作用,这就是被人熟知的CRISPR/Cas9的技术基础。在鼠疫耶尔森菌中，有3个CRISPR位点，并且位于鼠疫菌基因的不同位置，同向重复大多数都很保守，而且序列具有很高的多态性，可以作为细菌分型及进化的一个技术[8-9]。近年来我国也展开了鼠疫菌CRISPR基因分型、进化方面的研究工作，比如徐小青等将青海省102株鼠疫菌进行CRISPR分型，共发现24个CRISPR基因型9大类群[10]，杨光璨将云南省171株鼠疫菌分为3个基因簇和4个基因型[11]，葛亚俊将甘肃193株鼠疫菌分为2个基因簇个4个基因型[12]，新疆也开展了鼠疫CRISPR分型研究[13]，特别是Cui等人将我国12类鼠疫自然疫源地的菌株分为9个CRISPR基因簇群，共37种基因型，对我国鼠疫菌CRISPR的分型研究工作具有重要的意义[14]。四川省鼠疫疫源地不仅发现较晚，而且在基因分型相关方面的研究起步也晚，为了分析四川鼠疫菌基因分型和地理分布，开展了鼠疫菌CRISPR基因分型研究工作。现将实验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1实验菌株 选择来源于1997—2016年四川鼠疫疫源地具有代表性的132株鼠疫菌，其中石渠县58株，德格县25株，巴塘县6株，理塘县8株，雅江县34株，新龙县1株，菌株涵盖了四川所有的鼠疫疫源县。

1.2鼠疫菌培养及核酸提取 将鼠疫菌接种于赫氏平板上，28 ℃培养24 h，按照Wizard Genomic DNA Purifcation Kit操作规程在中国疾病预防控制中心P3实验室中提取鼠疫菌核酸。

1.3 试剂及仪器耗材

1.3.1试剂 超纯水；含有buffer、dNTP 、Taq DNA聚合酶的PCR扩增混合液(Taq Mix(2xEasy Taq○RTM PCR SuperMix +dye，全式金生物技术有限公司)；TBE电泳缓冲液；琼脂糖；核酸染料；DNA Marker (100bp Plus DNA Ladder Marker, 全式金生物技术有限公司)。

1.3.2仪器和耗材 PCR扩增仪、水平电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪。10 μL,100 μL,200 μL,1000 μL的移液器及其枪头，0.2 mL PCR反应管，1.5 mL EP管，以及离心机(可调14K转)。

1.4引物和PCR扩增方法 使用YPa-L：(5′-AATTTTGCTCCCCAAATAGCAT-3′)，YPa-R：(5′-TTTTCCCCATTAGCGAAATAAGT A-3′)；YPb-L：(5′-ATATCCTGCTTACCGAGGGT-3′),YPb-R：(5′-AATCAGCCACGCTCTGTCTA-3′)和YPc-L：(5′-GCCAAGGGATTAGTGAGTTAA-3′)，YPc-R：(5′-TTTA CGCATTTTGCGCCATTG-3′)3对扩增引物，引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，按照引物检测报告说明使用。PCR反应体系25 μL：超纯水7.5 μL，2×PCR Supermix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL。PCR扩增条件：预变性:95 ℃，5 min；变性：95 ℃，40 s,退火：55 ℃，40 s，延伸：72 ℃，40 s，共30个循环；再延伸：72 ℃，5 min。

1.5测序 电泳确定PCR扩增成功后，对PCR产物送测序技术服务公司(北京睿博兴科生物技术有限公司)进行双向测序，获得拼接后的序列资料，通过CRISPR网络服务器(http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/)中的“CRISPRs Finder”工具得到CRISPR Cluster与Genotyper 的相关信息。根据Cui等人[4]提出的命名方法和序列资料将间区序列命名和分型。最后，结果整理成Excel形式保存。

1.6分析方法 Excel 2007和MapInfo软件进行数据分析。

2 结 果

2.1四川省鼠疫菌地理分布 依据1997—2016年四川省鼠疫疫源地调查结果，青海田鼠型的鼠疫菌株分布在石渠县俄多玛乡红旗桥地区，而石渠县1997年人间鼠疫发生时分离的鼠疫菌来源于石渠县呷仪乡(流行病学证实由青海省输入)，德格县的鼠疫菌菌株分布在雀儿山以西的柯洛洞乡、更庆镇乡和八邦乡，巴塘县(亚日贡乡、德达乡和茶洛乡)、理塘县(禾尼乡)、雅江县(红龙乡和柯拉乡)和新龙县(友谊乡)菌株分布在以格聂山为中心的周围地带。所有菌株都分布在金沙江(左)和雅砻江(右)之间的山脉，暨沙鲁里山脉—金沙江和雅砻江的分水岭，见图1。

2.2四川省鼠疫菌CRISPR分型结果 四川省132株鼠疫菌共发现17种spacer，包括YPa 9种、YPb 5种、YPc 3种，新发现的1种space阵列。所有鼠疫菌株被分为2个CRISPR基因簇(Cc3′,Ca7)，3个基因型(37′型、22型和sc01型)。其中石渠县57株青海田鼠型鼠疫菌基因型为37′型,石渠县1999年人间鼠疫的菌株为22型，德格县25株旱獭型鼠疫菌基因型为22型，巴塘县、理塘县、雅江县和新龙县共49株旱獭型鼠疫菌基因型为sc01型。见表1。

图1 四川省鼠疫菌地理分布图Fig.1 Geographical distribution of Y. pestis strain in Sichuan province

表1 四川鼠疫菌CRISPR分型结果
Tab.1 CRISPR-genotype results of Y. pestis strains in Sichuan province

地点数量宿主序列YPaYPbYPcCRISPR基因簇基因型石渠县57青海田鼠a1-a4-a6'b1-b2-b3-b4-b10c1-c2-c3Cc3'37'石渠县1人a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7b1-b2-b3-b4c1-c2-c3Ca722德格县25喜马拉雅旱獭a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7b1-b2-b3-b4c1-c2-c3Ca722巴塘县6喜马拉雅旱獭a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7-sc1b1-b2-b3-b4c1-c2-c3Ca7sc01理塘县8喜马拉雅旱獭a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7-sc1b1-b2-b3-b4c1-c2-c3Ca7sc01雅江县34喜马拉雅旱獭a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7-sc1b1-b2-b3-b4c1-c2-c3Ca7sc01新龙县1喜马拉雅旱獭a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7-sc1b1-b2-b3-b4c1-c2-c3Ca7sc01

注：sc01为新发现的 Spacer，序列为5′-GTTTTCACCACCGCCGTGACATTCTTCCGGC-3′,位于CO92，CP009973.1：548129-548159.

2.3四川省鼠疫菌CRISPR基因分型分布 四川省鼠疫菌CRISPR基因型具有明显的地理分布特征，基因37′型分布在四川省甘孜州石渠县俄多玛乡(省道217附近)，基因22型分布在四川省甘孜州德格县(国道317附近)，基因sc01型分布在四川省甘孜州巴塘县、理塘县、新龙县和雅江县(国道318附近)，由于石渠县人间鼠疫由青海省传入，该菌株未列入四川省鼠疫菌CRISPR基因分型分布图。见图2。

图2 四川省鼠疫菌CRISPR基因分型分布图Fig.2 CRISPR-genotype geographical distribution of Y. pestis strain in Sichuan province

3 讨 论

四川省鼠疫疫源地位于四川省甘孜藏族自治州，西与西藏相邻，北与青海省相邻，是青藏高原的一部分，地形地貌气候复杂。从四川鼠疫菌菌株地理分布看，我省所有鼠疫菌都分布在金沙江和雅砻江之间，暨沿着沙鲁里山脉(莫拉山—子拉山—雀儿山—治南山—素龙山—扎噶山)一线分布，菌株的分布具有明显的地理分布特征。本研究利用鼠疫菌CRISPR分型方法，将四川省132株鼠疫菌株分成2个CRISPR基因簇(Cc3′,Ca7)和3个基因型(37′型、22型和sc01型)，并且发现一个新的Spacer，将该基因型命名为sc01型。37′型分布在石渠县，22型分布在德格县，sc01型分布在巴塘县、理塘县、雅江县和新龙县，可见四川省鼠疫菌CRISPR分型具有明显的地理分布特征。石渠县Cc3′(37′)型与徐小青等[10]研究的青海省称多县青海田鼠鼠疫自然疫源地G6a型相同，且与Cui[14]研究发现的石渠县鼠疫菌Cc3在a6有区别(在3′端少CA两个碱基),和内蒙锡林郭勒布氏田鼠鼠疫自然疫源地Cc1(36型)相比在YPb少了b10和YPc少了c2和c3。石渠人间鼠疫的菌株为Ca7(22型)，已经从流行病学调查中证实此菌株由青海省输入(图1青绿色箭头)。该菌株的型别与德格县的菌株Ca7(22型)相同，并且青海省的玉树、囊谦、曲麻莱和称多等地的菌株为Ca7型[10],而西藏的菌株主要为Cb4型[14]，云南的菌株为Ca52(剑川)、Ca8及Ca7型(玉龙)[11]。但是云南丽江玉龙位于四川甘孜州下部，靠近四川凉山州盐源县和攀枝花的格萨拉地区，可以确定四川省德格县的鼠疫菌菌株应该由青海省玉树市传入，鼠疫菌继续沿着德格县境内的雀儿山山脉继续向南传播，在遇到不同的生态环境，为了适应当地的生态压力，其基因也发生了改变，逐步进化出sc01型(图1红色箭头)。另外从四川的鼠疫疫源地近30多年的调查来看，在雅砻江的右岸地区，如甘孜县、色达县、炉霍县和道孚县等地并未发现阳性犬血清和分离出鼠疫菌株，并且在四川攀枝花市发现阳性血清的西区和福田地区也位于金沙江和雅砻江之间。从以上分析可以推断出四川省甘孜州鼠疫疫源地只分布在金沙江和雅砻江之间，这对甘孜州、凉山州和攀枝花今后鼠疫疫源地调查有着一定的指导依据。