普通PCR检测方法在西藏地区鼠疫疫情判定中的应用

格桑曲珍 索朗德吉 占堆

【摘 要】

目的：了解聚合酶链反应（PCR）检测方法在鼠疫疫情判定中的应用。方法：通过检测鼠疫耶尔森菌一个特异的目的基因（F1抗原基因、pla基因）检测鼠疫耶尔森菌。结果：2只病死旱獭脏器组织经PCR检测，均呈现两条与预期分子量相吻合的清晰目的扩增带。与胶体金、反相血凝试验（堆龙材料1：320、城关区材料1：5120）阳性完全相符。结论：PCR检测方法具有快速、特异、敏感的特点，在基层，偏远地区大力推广，对及时、准确判定鼠疫疫情及处置疫情，防止疫情蔓延具有重要的意义。

【关键词】 普通PCR；鼠疫；疫情判定

Abstract Objective： understand the application of polymerase chain reaction （PCR） in the determination of plague outbreak.

Methods： a specific target gene （F1 antigen gene， PLA gene） was tested for yersinia pestis Results： PCR revealed two clear objective amplification bands that were consistent with the expected molecular weight. The results were consistent with the positive results of colloidal gold and reverse hemagglutination test （duilong material 1：320 and chengguan area material 1：5120）.

Conclusion： PCR detection method has the characteristics of quick， specific and sensitive. It is widely used in grassroots and remote areas， which is of great significance for timely and accurate judgment of plague outbreak and treatment of epidemic situation and prevention of epidemic spread.

【中图分类号】R969.4 【文献标志码】

B 【文章编号】1005-0019（2018）14-011-01

鼠疫作为一种古老的疾病被世界卫生组织定为重新复燃的20种传染病之一，目前其流行进入一个新的活跃期[1]。西藏自治区自1966年-2017年50多年期间共判定了52个县为鼠疫自然疫源地，面积84.85万平方公里，占全区总面积的70.7%，且近年来疫情呈上升趋势，对人类健康造成严重威胁。然而我区目前主要应用传统的“四步检验”方法，存在繁琐、费时和受材料腐败等诸多因素的影响，给疫情的及时、准确判定带来了一定困难。通过对疫区鼠疫患者和疑似患者、流行区和非流行区鼠类、实验感染动物和蚤等材料进行的现场检测和实验室研究，证明PCR检测方法有高度的特异性和敏感性[2]。因此，2017年開始西藏地区逐步在鼠疫检验中推广应用PCR方法，并成功判定了2起动物间鼠疫疫情。

1 材料与方法

1.1 被检材料 采集于拉萨市堆龙德庆区德庆乡和城关区夺底乡2只病死旱獭脏器组织（心、肝、脾、肺）。

1.2 模板制备 取0.1g脏器研磨后取50ul上清液加入50ul无菌去离子水，倒入1.5ml微量离心管中，煮沸15min，离心10min（12000r/min），取上清液1-5ul进行PCR检验。

1.3 引物 选择引物pla和F1基因片段，由上海辉睿生物科技有限公司合成供给。（生产批号：HR170420）.

1.4 PCR反应及扩增产物分析：试剂盒的鼠疫耶尔森菌为阳性对照，Rnase H2O为阴性对照，PCR-Marker为标准分子量，按试剂盒说明书配置反应体系进行PCR扩增及凝集电泳分析。

2 结果

2只病死旱獭脏器组织核酸提取后经PCR检测，均呈现两条与预期分子量相吻合的清晰目的扩增带（F1：249bp；pla：456bp）。（图1、图2）。

3 结论

准确判定一起鼠疫疫情，最终依据鼠疫实验室诊断结果。根据2008年9月新修订的《中华人民共和国卫生行业标准WS279-2008鼠疫诊断标准》[2]，对未分离到鼠疫菌的疑似标本，除要求免疫学检测阳性外，还要求基因检测阳性，方可做出判断[3]。经普通PCR检测，2只病死旱獭基因扩增结果（图1、图2）与胶体金、反相血凝试验（堆龙材料1：320、城关区材料1：5120）阳性完全相符，在6-8小时内成功判定了2起动物间鼠疫疫情，改变了以往只有分离到鼠疫菌才能确诊的局面，为疫情处置争取了第一时间。

以往西藏地区鼠疫疫情绝大多数发生在地广人稀，交通不便的农牧区，呈散发和小流行，即使发生疫情，能通过传统的“四步检验”方法，判定疫情并控制疫情的蔓延。如今西藏旅游业快速发展，资源开发利用，疫区人类活动频繁，交通工具发达，人员流动大，为疫情的远距离传播创造了有利条件。西藏疫区面积大，发现病死旱獭尸体时，材料已经腐败严重或只剩下残体，再送到地市级疾控中心强毒室时，经常出现胶体金、反相血凝试验结果阳性，却检不出鼠疫菌，“四步检验”方法无法及时准确判定疫情。

新的诊断标准出台后，一起鼠疫疫情的判定不需要等1-2天的细菌培养结果，大大缩短了确诊时间，而且非常特异、敏感，节约人力、物力及经费，是紧急情况下检测鼠疫的有力手段。因此，PCR检测方法在基层，偏远地区大力推广，对及时、准确判定鼠疫疫情及处置疫情，防止疫情蔓延具有重要的意义，从而保障人民群众的生命财产安全。

参考文献

[1] 顿珠，其加次仁，多吉格桑，等.加强鼠疫监测 严防人间鼠疫 确保边疆稳定[J].西藏医药杂志，2013，34（04）：44-45.

[2] 石丽媛，郭英，张福新，等.应用PCR方法检测鼠疫现场标本的研究[J].疾病预防控制通报，2013，28（2）：1-3.

[3] 中华人民共和国卫生部.WS279-2008 鼠疫诊断标准[S].北京：中国标准出版社，2008.

[4] 王鹏，张福新，郭英，等.云南省玉龙县一起鼠间鼠疫的实验室判定[J].中国卫生检验杂志，2015，25（8）：1105-1107.