EGFR和TREM—1在食管癌中的表达及黄芪多糖通过抑制炎症因子辅助食管癌治疗的作用研究

孙小虎 王璐 于洪 张文陆

【摘 要】

目的：探討表皮生长因子受体（EGFR）和髓系细胞触发受体1（TREM-1）在食管癌（EC）组织中的表达及其与临床病例特征之间的关系。方法：选取食管癌组织及癌旁组织各72例，采用SP免疫组化染色法检测EGFR及TREM-1的表达，分析两者与EC之间的临床病理相关性。另选取食管癌患者术后给予APS注射液，测定APS对血生化指标的影响；采用ELISA法检测炎症因子IL-2，IL-6的含量。结果：食管癌组织中EGFR和TREM-1的阳性表达率高于癌旁组织，两者呈正相关（P<0.05）。EGFR的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及临床分期相关，TREM-1的表达与淋巴结转移相关。黄芪多糖治疗可以改善EC手术患者生化指标，降低IL-2和IL-6的水平，与P-CT组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：EGFR与TREM-1在EC组织中高表达，且EGFR与TREM-1两者之间的表达呈正相关性。可作为食管癌预后判断和基因治疗的分子靶标。

【关键词】 食管癌；表皮生长因子受体；髓系细胞触发受体-1

【中图分类号】R446.1 【文献标志码】

A 【文章编号】1005-0019（2018）14-003-01

Expression of EGFR and Trem-1 in Esophageal Carcinoma and the Inhibiting Role of APS in the Treatment of EC by Inflammatory Factors

SunXiaohu1，2，Wang Lu2， Yu HONG2，Zhang Wenlu1*

（1.Jinzhou Medical University，Liaoning，Jinzhou 121001；2.Liaoning Cancer Hospital，Liaoning，Shenyang 110042）

Abstract Objective： The aim of this study is to investigate the expression and clinical significance of EGFR （epidermal growth factor receptor） and TREM-1 （trigger receptor of myeloid cells -1） in esophageal carcinoma （EC）. Methods： The study tested 72 cases of EC tissues and 72 cases of para-carcinoma tissue. The expressions of EGFR and TREM-1 were detected by SP immuno-histochemical method.Then analyze the relationships and the correlations between these two antibodies and the clinical pathological factors of esophageal carcinoma. Moreover， APS were given to EC patients， then monitored the numerical value；Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was was used to test the numerical value of IL-2，IL-6.

Results： Compared with para-carcinoma tissue group， the expression of EGFR and Trem-1 were significantly increased in EC group，there was a positive correlation between the expression of the two （P<0.05）. The expression of EGFR was possitively correlated to depth of invasion，lymph node metastasis and clinical stages；the expression of TREM-1 was possitively correlated to depth of lymph node metastasis. Compared with normal control P-CT group， the level of IL-2 and IL-6 in APS group were decreased， and the biochemical criterion were significantly IMPROVed in APS group （P<0.05）.

Conclusions： The expression of TREM-1 and EGFR were significantly increased in EC and P-CT groups， and the expression of EGFR and TREM-1 were possitively related. ， and may be employed to indicate the biomarker of prognosis of esophageal carcinoma patients and regarded as a target of gene therapy.

Key words：esophageal carcinoma； epidemal growth factor receptor；triggering receptor expressed on myeloid cells-1

食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一。我国EC的患病率近年呈逐年递增趋势，发病人群也逐渐呈年轻化趋势[1，2]。手术治疗仍是EC的首选治疗手段，而晚期患者只能以延长生存时间及改善生存质量为主要治疗目的[3-5]。髓系细胞触发受体通过调节炎症反应，进而影响多种肿瘤的发生、发展及预后[6]。表皮生长因子受体在多数人类肿瘤中也出现高表达。另外，白介素-2，白介素-6在肿瘤，特别是在EC中也表现出高表达的现象[7，8]。本研究检测EGFR和TREM-1在EC组织及癌旁组织中的表达情况，探讨EGFR与TREM-1的表达与食管癌的临床病理特征的关系，为EC的诊断、治疗及预后提供客观的参考指标；检测EC组织中炎症因子IL-2，IL-6的含量，同时为EC的传统中药综合疗法提供临床理论指导。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 组织标本 本研究随机选取并整理了2016年3月至2017年6月于辽宁省肿瘤医院胸外科行手术切除并经病理证实为EC的患者共72例作为受试对象。所有病例经核实患者无重复，临床病理资料完整。

1.1.2 试剂及耗材 兔抗人表皮生长因子（即用型）（GT209307）购自基因科技有限公司；兔抗TREM-1抗人单克隆抗体（ab214202）购自英国Abcam公司；IL-2，IL-6酶聯免疫检测试剂盒购自美国R&D; SYSTEMS公司；EDTA抗原修复液购自北京雷根生物技术有限公司；注射用黄芪多糖（伯恩）购自天津赛诺制药有限公司。

1.1.3 主要仪器 石蜡切片机（LEICA-RM213）购自德国莱卡公司；台式水浴恒温振荡器（TSHZ-A）购自上海跃进医疗器械厂；全自动化学发光免疫分析仪（SIEMENS Advia Centaur XP）购自德国西门子公司；Olympus光学显微镜（H-600）购自日本Olympus公司；德国生物信号显微镜购自德国Carl Zeiss公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组和标本处理 本实验共分为二组：疾病模型组（EC组）：选取EC患者共72例，经患者签署知情同意书后，将受试患者的病理腊块标本及其相关的临床病理资料作为疾病模型组。癌旁组织组（P-CT组）：选取上述72例食EC患者的癌旁组织（食管癌边缘外≥2cm），作为癌旁组织组。

上述受试患者的食管标本离体30min内进行处理。按照分组要求，切取面积约1.0cm×1.0cm的食管组织作为受试组织。取出的食管组织立即采用生理盐水（Normal saline，NS）进行漂洗，放入10%甲醛当中进行固定，标本常规脱水、石蜡包埋，进行SP免疫组化，观察病理改变。

1.2.2 SP免疫组化 高压加热沸腾 修复抗原，3%H：O：去离子水以阻断内源性过氧化物酶活性，分别滴加兔抗人表皮生长因子（1：200）、兔抗TREM-1抗人单克隆抗体（1-200）（一抗），室温孵育1h，滴加二抗，室温孵育 30 min，PBS冲洗2 rain×3次，每张切片滴加DAB 显色剂100 Ixl，室温显色，镜下控制反应时间，PBS 洗涤，苏木精复染，常规脱水，透明，中性树胶封片。

1.2.3 结果判定 在双盲条件下进行染色结果判定，每张组织切片在400倍光学镜头下随机选取10个视野，依照细胞染色部位，染色密度及染色强度进行结果判定。细胞核及细胞质染色评分：染色面积评估：随机选取10个视野，计数染色面积测定。0分：无阳性细胞；1分：≤25%；2分：26-50%；3分：51%-100%。染色强度评分：指多数阳性细胞呈现的染色特性：0分：无着色；1分：淡黄色；2 分：棕黄色；3 分：棕褐色。表达水平通过细胞染色比例及染色强度得分乘积判定。细胞膜评分：0分：无反应或少于10%的细胞膜染色；1分：≥10%的细胞膜出现微弱染色；2分：≥10%的细胞侧膜、基底侧膜或完全膜出现中度染色；3分：≥10%细胞强染色出现在侧膜、基底膜或全部染色； 上述分数之和用来判断Trem-1和EGFR结果，>2分者为阳性，≤2分者为阴性。

1.2.4 术后黄芪多糖治疗 在本部分中另外选取经手术治疗的食管癌患者20名及健康人10名作为受试对象，分为三组：空白对照组（N组）：10名健康人作为空白对照，不给予任何处理因素，只取血样作为空白对照组。食管鳞癌术后模型组（EC组）：选取EC切除术后患者10名，术后给予常规处理，签署知情同意书，入组。黄芪多糖治疗组（APS组）：选取于我院行食管癌切除术治疗的患者10名，术后予常规处理，给予APS注射液综合治疗，一次250mg，一日1次，用药疗程2周。

上述EC组及APS组受试对象，于术前及术后2周、N组于术前相同时间段分别采血，测定各组血清谷草转氨酶、总蛋白、白蛋白及特异性肿瘤生长因子数值，并进行统计学分析。

上述EC组及APS组受试对象经APS治疗2周后，采血，采用ELISA法测定炎症因子IL-2及IL-6的含量。将标准品稀释配制成相应浓度的标准品，加样，配液，洗涤，显色，终止反应。测定：用酶标仪于530nm处，测定各孔的吸光度值（OD值）；通过已知标准品的浓度及检测出的标准品的OD值，计算各组检测样品的浓度。测定IL-2、IL-6的结果以nmol/mg 蛋白表示。以上实验重复3次。

1.3 统计分析 采用SPSS17.0统计软件对实验所得数据进行统计学分析。所有实验数据以均数±标准差（x-±s）表示。两组间的数据比较，采用独立样本t检验；对计数资料行2 检验；多组数据间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR在食管癌及癌旁组织中表达 免疫组化显示，EGFR的阳性表达表达在食管鳞癌组织中主要定位于细胞膜及细胞浆内；而在癌旁组织中弱表达于细胞膜上。阳性表达率分别为72.2及31.8%，两者之间差异具有统计学意义（

2.2 TREM-1在食管癌及癌旁组织中的表达情况 免疫组化实验结果显示，TREM-1的阳性染色在EC组中主要定位于细胞核及细胞浆中，在P-CT组中弱表达于细胞膜中，阳性表达率分别为69.4%及32.7%。两组间比较，差异具有统计学意义（2=11.514，P<0.001）（见图2A、2B）。

2.3 EC中EGFR和TREM-1的表达与临床病理特征的关系 对本实验中EGFR和TREM-1在食管鳞癌中的的表达结果进行分析，EGFR的表达与年龄、性别、组织分化程度无相关性（P>0.05），与肿瘤的浸润深度（P=0.004）、淋巴结转移（P=0.001）、临床分期（P=0.012）存在相关性（P<0.05）。TREM-1的表达与年龄、性别、分化程度、肿瘤大小及TNM分期无相关性（P>0.05），在有、无淋巴结转移的食管鳞癌组织中的阳性率分别为77.1%和54.1%，差异具有统计学意义（P<0.05）（见表1）。

2.3 EC中EGFR和TREM-1的表达的相关性 在72例EC患者的食管组织中，TREM-1和EGFR共同阳性表达例数为46例，共同阴性表达例数为16例，经X2 检验列联系数分析，两者之间的表达成正相关（r=0.520，P<0.001）（见表2）。

2.4 术后APS对各组的治疗作用比較

2.4.1 APS对血生化等指标的影响 检测与EC手术后治疗情况密切相关的相关血生化等因子，包括TSGF、AST、TP和ALB。经过统计学分析，得出如下结果：ASP组及EC组（术前及术后2周）的血生化指标与N组相比，TSGF、AST值升高，TP和ALB值下降，结果差异显著，具有统计学意义（P<0.05）；在ASP组中，经过ASP治疗2周后的各个血生化指标与ASP治疗前相比，TP和ALB值升高，TSGF和AST值下降，差异有统计学意义（P<0.05）。另外，术前对比术后2周的ASP组及EC组同组别之间的生化指标变化幅度，ASP组中TP和ALB值升高幅度及TSGF和AST值下降的幅度更明显，存在显著性差异，有统计学意义（P<0.05）（见表3）。

2.4.2 ASP对术后炎症因子IL-2、IL-6的影响检测EC术后应用ASP治疗后炎性因子IL-2和IL-6的水平变化。ASP组患者的炎症因子IL-2和IL-6水平与N空白组相近，无显著性差异（P>0.05）。然而，将单纯手术治疗的EC组分别与N空白组和ASP治疗组相比，炎性因子IL-2和IL-6均升高，差异具有统计学意义（P<0.05）（见表4）。

3 讨论

食管癌（EC）是我国常见的恶性肿瘤之一，近年来，EC除了患病率呈现逐年递增趋势，患者也逐渐呈现年轻化的趋势。手术治疗仍然是EC所采用的的首选治疗手段，目前，传统中药逐渐应用到肿瘤的治疗中，作为综合治疗手段，中药越来越突显出其治疗的有效性。综合治疗对早、中、晚期的EC患者均有良好的治疗作用[9，10]。

近年来的研究发现，TREM-1通过调节炎症反应影响了食管癌的发生、发展及预后[11，12]；与其相似，EGFR也是一种跨膜的炎性蛋白。本实验免疫组化结果显示，在EC的SP染色的组织切片中，TREM-1阳性染色主要定位于细胞核及细胞浆中，EGFR阳性表达主要集中在细胞膜及细胞浆内；P-CT组中TREM-1和EGFR主要弱表达于细胞膜上，说明TREM-1和EGFR在EC中高表达，提示食管癌的发生、发展与TREM-1和EGFR密切相关。TREM-1和EGFR在EC中过度表达，且与肿瘤的TNM分期、是否存在淋巴结转移以及浸润深度存在相关性。这提示TREM-1和EGFR可能作为早期诊断EC的重要指标，可以为EC的临床诊断起到一定的辅助作用。

通过本次实验研究，我们还可以看出，EGFR与TREM-1在EC的表达中存在正相关性（r=0.520，P<0.05），提示两者在EC的发生发展中存在某种协同作用。

在本试验中，通过对EC手术切除肿瘤的患者给予传统中药黄芪多糖进行综合治疗，我们可以得知，与单纯手术治疗的EC患者相比，TSGF、AST值显著下降且TP和ALB值升高。该结果提示，APS对EC手术患者有明显的治疗作用，降低患者术后的并发症，改善患者的生活质量和生存时间。我们也可以发现，APS治疗能明显降低炎性因子IL-2及IL-6含量。因此，在EC的治疗中，应采取手术治疗合并中药治疗的综合疗法。中药与手术治疗相结合有诸多好处，手术前应用中药扶正治疗，可减少手术中的并发症。手术后应用的中药抗肿瘤治疗，可以控制癌症的发展，以扶正和驱邪相结合，对治疗EC有良好的治疗效果[13]。

综上所述，本实验结果证明了TREM-1和EGFR在CRC组织中的高表达，对结肠癌的的发生、发展起调节作用，为临床防治CRC提供了重要的理论依据。同时，EC患者术后辅助以APS治疗，能通过降低炎症因子的表达，改善EC患者的血生化指标，对开展食管癌辅助治疗具有重要的实践意义。

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