平菇栽培及平菇中酪氨酸酶活力抑制的动力学研究

陈骏颖　冯学军　罗子皓　吴江维　焦元红　杨裕启

摘 要 本实验前期对平菇进行栽培，中期对平菇中酪氨酸酶提取和纯化，后期对得到的氨酸酶进行活性抑制的动力学研究。用紫外分光光度计检测不同pH、温度、抑制剂下酶活力，实验结果表明： pH值为6.8，温度为30℃时，平菇中酪氨酸酶催化活力最大，其中0.3mmol/L的L-半胱氨酸对酪氨酸酶有较好的活力抑制作用，且L-半胱氨酸对酪氨酸酶的抑制类型为不可逆竞争性。

关键词 平菇 酪氨酸酶 褐变 催化活力 抑制作用 动力学

中图分类号：Q939 文献标识码：A

平菇是一种可食用的植物门侧耳真菌。平菇栽培有着可观的经济效益，但由于平菇组织细胞中含有大量水，平菇表面保水能力又较弱，室温下采摘后若不经过处理，平菇菇体1-2天便会大量失水，菌盖收缩，菌体发生明显褐变。催化平菇发生褐变的酶是酪氨酸酶（PPO）。本此实验选用平菇作为PPO的来源，用邻苯二酚做底物来研究酪氨酸酶在不同pH值、温度时的表现出的催化活性情况，以及加入乙酸、柠檬酸、L-半胱氨酸、NaCl等不同的抑制剂的抑制效果，以及平菇中酪氨酸酶对L-半胱氨酸的抑制类型，从而为平菇后期的处理和保存提供理论指导，具有积极的实践指导价值。

1主要仪器与药品

立式压力灭菌锅（LDZX-50KAS）； UV-1800紫外分光光度计（日本岛津有限公司）；BS 224 S电子天平；（北京赛多利斯仪器系统有限公司）； UB-7酸度计（北京丹佛仪器有限公司）； DF-101B集热式恒温磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限公司）； QY-1000A移液器（北京青云卓立精密仪器有限公司）；氯化钠（AR.国药集团化学试剂有限公司）；L-半胱氨酸（AR.上海谷研生物科技有限公司）；邻苯二酚；磷酸氢二钠；磷酸二氢钠；冰乙酸（AR.天津市天力化学试剂有限公司）；柠檬酸（AR.北京康普汇科技有限公司）。

2实验方法

2.1栽培方法

首先制作培养基，然后装袋，置于高压蒸汽灭菌锅中设置温度为120℃、时间为120min。灭菌完成后，带菌棒冷却后将菌种均匀撒一薄层于培养基两端，用白纸封口，置于培养房中定期浇水。

2.2 PPO粗酶液的提取

采用机械破碎法对蘑菇细胞进行粉碎，采用冰丙酮法对酪氨酸酶进行提取，蘑菇的质量与冰丙酮的体积之比为1：2。得到滤饼，用冰丙酮反复冲洗，直到无色。滤液加入等体积饱和（NH4）2SO4低温放置，待沉淀完全后进行离心，0 ℃下， 10000 r·min-1离心 10min，收集沉淀物。得粗酶73.076g。

2.3粗酶液的纯化

2.3.1 SePhadex G-100凝胶柱层析分离

首先从层析柱上端以一定速度通入磷酸缓冲液，当下端流出液在分光光度计280nm处检测下吸光值小于0.05时，平衡完成。开始进样。待层析柱平衡完成后，将进样管接入样品管中，上样，其中应控制进样速度与洗脱速度相当，进样速度为6r/min。待样品完全进入后，进样管插入缓冲液中，进行洗脱，同时记录仪器上的吸光值，每5min记一次，流出液达到5mL时，换管。继续洗脱并收集流出液，直至吸光值接近0为止。

2.3.2纯化酶的收集

取微量邻苯二酚溶于少量水中，取6只试管，将邻苯二酚溶液均分至这6只试管内，分别从对应序号的试管内吸取少量酶液，震荡，放置10min，對比试管颜色变化。颜色较深，说明酶量较多，颜色较浅，表明，几乎不含PPO。将含有PPO的流出液分别倒在50mL的烧杯中，再倒入10mL的冰丙酮提取，放置冰箱冷却，有PPO的絮凝产生，2h后，对絮凝后的PPO进行离心，取沉淀物，再对沉淀物进行真空冷冻干燥。

2.3.3 PPO活力的测定

首先配制0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液）和浓度为0.01mol/L邻苯二酚溶液，再将1.910mg的纯化后的酪氨酸酶溶于5mL缓冲液（pH=7.0）中。取3mL缓冲液（pH=6.8）加入比色皿中，再用移液枪取0.1mL的邻苯二酚溶液，再取0.1mL的PPO，摇匀，立即在402nm下，3min内每10s记录一组吸光值A。实验结束后作吸光值 A与反应时间t的关系曲线图，由曲线最初直线段的斜率（ A/t）计算PPO活力。

2.3.4 pH对酶活力的测定

配制pH值为4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0的磷酸盐缓冲液，在比色皿中分别加入3mL上面所配制的缓冲液，再用移液枪取0.1mL的邻苯二酚溶液，再取0.1mL的PPO，摇匀，立即在402nm下，3min内每10s记录一组吸光值A。由曲线最初直线段的斜率（ A/t）计算PPO活力。

2.3.5温度对酶活力的测定

在比色皿中加入3mL的缓冲液（pH=6.8），用水浴锅对邻苯二酚溶液进行加热，温度梯度为15、20、25、30、35、40、45、50、55、60，在相应温度下保温3min。再用移液枪取0.1mL的邻苯二酚溶液，换掉枪头后，再取0.1mL的PPO，摇匀，立即在402nm下，3min内每10s记录一组吸光值A。由曲线最初直线段的斜率（ A/t）计算PPO活力。

2.3.6抑制剂对酶活力的测定

用3mL，pH=6.8的缓冲溶液配制浓度如表 1所示的乙酸、柠檬酸、L-半胱氨酸、NaCl溶液，采用如上方法。3min内每10s记录一组吸光值A。由曲线最初直线段的斜率（ A/t）计算PPO活力。计算PPO在不同浓度值下的相对酶活，并计算抑制率。

3结果与讨论

3.1平菇的栽培

在后期的栽培过程中，有个别菌棒产生霉菌，致使该菌棒的生长受到影响，其他菌棒生长情况良好， 28天左右，整个菌棒长满菌丝，菌棒呈现白色，变轻，之后3天，菌棒两端开始长出幼小的子实体，随后3天，平菇成熟，可以开始采摘。

3.2平菇中PPO的提取和纯化

对沉淀物冷冻干燥后沉重，提取纯酶1.910mg，纯化收率为2.6%，纯化率在正常范围内。由于酶在生物体内的存在是微量的，平菇中PPO的活性在低温下受到很好的抑制，因此冷冻过会进行研磨，能有效的控制平菇发生褐变，还抑制了PPO被分解。

3.3 PPO的活性抑制的动力学研究

3.3.1 pH对PPO酶活力的影响

不同pH对PPO酶活力的影响如所示，PPO的相对酶活受pH值的影响较为明显，pH=6.8时达到最大酶活。在测定的pH值在4.0～8.0之间时，PPO的活性有一个先增强后减弱的过程，由此，在平菇的后期处理加工过程中，应尽量避免pH值接近6.8，而应该选择一个pH值大于8.0的环境进行储藏和加工。这样能有效抑制PPO酶的活性。

3.3.2温度对酶活力的影响

不同温度对PPO酶活力影响如图，PPO的相对酶活受温度影响呈一个波动的状态，但在局部范围内影响较为明显，在温度左接近30℃时其相对酶活达到最高峰值。有图可知，在15～60℃之间，PPO的活性先增强后减弱，当温度在20℃以下或50℃以上时，活性较弱。主要原因是温度较低时，酶促反应所需要的能量达不到，而溫度过高时，由于PPO是一种蛋白质，其过热变形失活，也使反应无法正常进行。由此可见，在在平菇的后期处理加工过程中，可利用低温抑制和相对高温失活的方法延缓褐变现象的发生。

3.3.3抑制剂对酶活力的影响

不同抑制剂对平菇PPO活力影响也不同，通过实验数据对比可知，L-半胱氨酸在低浓度时对平菇PPO的活性就表现出很强烈的抑制作用，在浓度为0.3mmol/L时就完全抑制了PPO的活性；乙酸对比其他两种抑制剂而言，其抑制作用也较强烈，乙酸浓度为0.20%即可达到84.3%的抑制率；柠檬酸和氯化钠同前两种对比，抑制作用不明显。

基金项目：大学生科技创新项目（项目编号：17cx15）；大学生创新创业训练（项目编号：201710920029）。

参考文献

[1] 邓雅元，罗晓莉等.不同贮藏温度对平菇采后生理的影响[J].农产品加工（学刊），2014，21（04）：9-11.

[2] Esma Hande. Purification of polyphenol oxidase from borage（Trachystemon orientalis L.） by using three-phase partitioningand investigation of kinetic properties[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2016，9（02）：7.

[3] 朱继英，王健，王相友.双孢蘑菇多酚氧化酶的分离、纯化及特性分析[J].园艺学报，2012，17（04）：763-768.

[4] 魏晓晖.双孢菇多酚氧化酶酶学特性研究[J].农业科技与信息，2016，32（01）.