内质网应激蛋白ATF4调控STAT3信号通路促进黑色素瘤细胞生长及转移的研究

张学军 亓发芝

[摘要]目的：探索内质网应激蛋白ATF4在黑色素瘤发生发展中的作用和机制。方法：运用荧光定量PCR技术分析对比黑色素瘤细胞系和黑色素细胞系内ATF4表达的差异，运用CCK-8染色以及BrdU染色检测细胞生长及增殖能力，运用Tranwell技术检测细胞转移能力，运用免疫印迹技术检测细胞内STAT3磷酸化水平。结果：ATF4 mRNA在黑色素瘤细胞中的表达水平显著高于黑色素细胞，显示肿瘤细胞中含有更高水平的ATF4 mRNA；在A375细胞中过表达ATF4后，细胞生长增殖速率提高，转移能力增强，而降低内源ATF4后，MM200细胞的增殖速度和转移能力都出现明显降低。同时，A375细胞内ATF4含量的增加也引起了细胞内STAT3磷酸化水平以及细胞内IL-6表达的显著升高。结论：内质网应激蛋白ATF4在黑色素瘤的发生发展中具有重要的调控作用，细胞内ATF4可能是参与调控了IL-6-STAT3信号通路，从而促进黑色素瘤细胞增殖和迁移。

[关键字]黑色素瘤；内质网应激；ATF4；肿瘤细胞增殖；肿瘤细胞侵袭；STAT3

[中图分类号]R739.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）07-0083-04

Abstract： Objective To explore the role of endoplasmic reticulum （ER） stress protein ATF4 in cell proliferation and metastasis of melanoma. Methods RT-qPCR was applied to investigate the levels of mRNA expression. CCK-8 staining and BrdU staining were introduced to determine the abilities of cell growth and proliferation. Transwell system was used to detect the metastasis ability of cells. Immunoblotting was conducted to determine the protein levels in cells. Results The levels of ATF4 mRNA significantly increased in melanoma cell lines when compared to melanocytes. Ectopic expression of ATF4 efficiently enhanced the proliferation and metastasis of A375 cells. Abrogation of ATF4 in MM200 impaired cell growth and metastasis. Furthermore， ATF4 overexpression upregulated the expression of IL-6 and subsequently activated STAT3 signaling. Conclusion In general， our results revealed that ATF4 regulated cell proliferation and metastasis via activating IL-6-STAT3 signaling in melanoma.

Key words： melanoma； endoplasmic reticulum stress； ATF4； tumor cell proliferation； tumor cell invasion； STAT3

黑色素瘤，通常又稱恶性黑色素瘤（malignant melanoma），是一种常见的恶性皮肤肿瘤，生长迅速。由于血管生成相对缓慢而容易造成营养和能量的供给不足，高速生长时期的黑色素瘤细胞内可能会发生多种应激状态，为应对这些生存环境的不利局面，细胞需要合成大量的蛋白（特别是分泌蛋白）去缓解外界生存环境的困局，而短时间内大量蛋白的合成给内质网（Endoplasmic reticulum， ER）带来了翻译和修饰的压力，会造成内质网内出现大量未折叠蛋白或者错误折叠蛋白的积累，从而产生内质网应激（ER stress）[1]，内质网应激会激活细胞内未折叠蛋白信号通路（The unfolded protein response pathway， UPR pathway）[2-4]。

近年来，越来越多的研究报道揭示了在肿瘤的发病过程中，UPR信号通路的关键作用[5-6]。在多种肿瘤的生长以及转移过程中，PERK-eIF2-ATF4信号突进都扮演着重要角色。肿瘤细胞中PERK-eIF2通路得不到有效激活，ATF4蛋白产生量过少时，肿瘤细胞在体外和体内的生长都会受到抑制[7-9]；在肿瘤细胞中敲除或者降低内源ATF4细胞的表达，可以有效抑制移植肿瘤的生长[7]，更有意思的是，如果在肿瘤细胞内过表达ATF4，细胞对多种抗肿瘤药物（如Cisplatin， Doxorubicin， Vincristine以及Etoposide）的抗性明显加强，体现了ATF4在肿瘤药物抗性中的重要作用[10-12]。此外，该信号通路在肿瘤细胞转移方面也有着重要功能，在乳腺癌中敲除PERK后，肿瘤细胞的转移能力明显受到抑制[9]，而ATF4作为PERK下游重要分子，在肿瘤的转移以及EMT中也起到非常关键的调控作用[13-14]。包括PERK-eIF2-ATF4通路在内的UPR信号通路在黑色素瘤中也扮演着重要角色，抑制细胞内PERK蛋白的活性，可以有效降低黑色素瘤的转移[15]，但是具体的分子机制仍不清楚。黑色素瘤细胞不同于正常皮肤细胞一个主要特点是：细胞快速生长需要有大量的新蛋白产生，从而可在细胞中引起内质网应激，激活UPR信号通路[1，16-17]。因此对内质网应激蛋白ATF4在黑色素瘤中的功能和分子机制的充分研究有助于黑色素瘤的临床治疗以及药物开发。本研究关注ATF4蛋白在黑色素瘤细胞增殖和迁移中的作用，初步探讨ATF4调控黑色素瘤细胞增殖和迁移的分子机制。

1 材料和方法

1.1 细胞培养：黑色素细胞系（HEMn-MP和HEMn-DP）和黑色素瘤细胞系（Mel-CV， MM200， A2058， A375和SKMel-28）均购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。所有细胞系均使用含10%胎牛血清（FBS，购自于Gibico公司）的DMEM高糖培养基（购自于Corning公司）培养，培养条件为37℃，5% CO2。

1.2 荧光定量PCR：荧光定量PCR检测方法参考文献[18]。细胞在经过相应培养或处理后，使用TRIZol（购自Invitrogene公司）固定细胞并按照产品说明提取细胞内总RNA，然后使用Takara公司RNA逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA。获得的cDNA使用Power SyberGreen Mix试剂盒（购自ABI公司）进行荧光定量PCR检测，检测机器为ABI公司生产7900荧光定量PCR仪。

1.3 免疫印迹：免疫印迹技术检测细胞中蛋白表达水平，具体方法参考文献[19]。细胞在经过相应培养或处理后，使用RIPA固定并裂解细胞，细胞内蛋白制成样品通过SDS-PAGE按蛋白相对分子量分离并转移到醋酸纤维素薄膜上，薄膜使用10%脱脂牛奶封闭后，按照需要分别孵育相应蛋白的一抗（Primary antibody），在4℃孵育过夜，然后使用辣根过氧化物酶交联的相应二抗（Secondary antibody）室温孵育1h，最后使用免疫印迹显色试剂盒（购自Thermo Fisherie Scientific公司）显色。

1.4 CCK-8和BrdU染色检测细胞增殖：Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒购自Dajino公司，按照产品说明书检测细胞增殖。在96孔板中接种相应细胞，每孔接种细胞数为1×103个，共分成6组，培养时间分别为4、24、48、72、96或120h，然后向相应组中加入CCK-8试剂，培养箱中继续孵育2h，最后使用酶标仪读取450nm的吸光度，以该吸光值为基础计算成细胞数目。BrdU细胞增殖检测试剂盒购自Cell Signaling Technology，按照产品使用说明书检测细胞增殖情况。

1.5 荧光素酶报告实验：本研究中使用荧光素酶报告基因实验检测ATF4对IL-6表达的调控作用，具体方法参考文献[19]。将包含人源IL-6的启动子的序列（2000bp）克隆到pGL3 basic质粒上，然后将该质粒与其它相应质粒共转染到HEK293T细胞中，细胞裂解液使用Dual-luciferase Assay Kit（购自Promega公司），按照产品说明书检测细胞中荧光素酶活性水平。

1.6 统计学分析：本研究所得结果，使用GraphPad 5.0软件进行统计学分析和处理。所有实验均进行3次以上，所有数据以（x?±s）表示，两组数据比较采用Two-tailed Students t-test方法，两组以上数据采用单因素方差分析（One-way ANOVA）或双因素方差分析（Two-way ANOVA），P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ATF4 mRNA水平检测结果：黑色素瘤细胞系Mel-CV、MM200、A2058、A375以及SKMel-28细胞中的ATF4 mRNA水平显著高于正常黑色素细胞系HEMn-MP，差异有统计学意义（P<0.05），说明在这些肿瘤细胞中，ATF4 mRNA含量相对较高，ATF4活性升高，可能与黑色素细胞病變为肿瘤细胞密切相关，并有可能参与调控了肿瘤细胞包括增殖和转移等特性相关。见图1。

2.2 黑色素瘤A375细胞ATF4转染结果：转染可高表达人源ATF4的质粒，提高了该细胞中ATF4的表达水平（见图2A）。CCK-8检测结果显示，A375细胞内ATF4含量增加后，细胞的生长速率显著提高（见图2B）；BrdU检测结果显示ATF4过表达促进了A375细胞增殖（见图2C）。实验结果说明，ATF4表达水平的提高可以促进黑色素瘤细胞生长及增殖；Transwell技术检测细胞转移能力，结果显示ATF4水平提高可以显著增加穿过小室薄膜的A375细胞数量，说明过表达ATF4可以增加黑色素瘤A375细胞的转移能力，ATF4具有促进黑色素瘤细胞转移的功能（见图2D～E）。

2.3 黑色素瘤MM200细胞si-ATF4转染结果：si-ATF4转染黑色素瘤MM200细胞，特异性降低该细胞中内源ATF4的表达水平（见图3A）。CCK-8检测结果显示，MM200细胞在ATF4降低后，细胞生长的速率明显降低（见图3B）； BrdU检测结果显示转染si-ATF4的细胞增殖能力减弱（见图3C）；Tanswell实验结果显示，随着ATF4含量的降低，穿过小室薄膜的肿瘤细胞的数量显著减少（见图3D～E），说明降低细胞内ATF4水平可以抑制MM200细胞迁移能力。

2.4 黑色素瘤A375细胞中IL-6表达水平检测结果：结果显示过表达ATF4后，A375细胞中IL-6 表达水平显著升高（见图4A），进一步研究发现，ATF4过表达的A375细胞内STAT3蛋白磷酸化水平显著升高（见图4B），说明增加细胞内ATF4可以促进STAT3信号通路的激活。利用IL-6受体（IL-6 receptor，IL-6R）抑制剂Sarilumab特异性阻断IL-6与IL-6R的结合，结果显示Sarilumab可以有效抑制ATF4过表达引起的STAT3磷酸化的升高（见图4B）。以上结果表明，黑色素瘤细胞中高水平的ATF4促进了细胞表达IL-6，从而提高细胞IL-6-STAT3信号通路的激活水平。

3 讨论

UPR信号通路在黑色素瘤发生发展过程中起到重要作用，但是具体的分子机制至今仍不是特别清楚。本次研究结果显示，相对于正常的黑色素细胞，黑色素瘤细胞中ATF4 mRNA水平显著升高，具有转录激活活性的ATF4蛋白增多。在黑色素瘤细胞中提高ATF4水平，会促进细胞表达更多的IL-6，通过自分泌作用使细胞内STAT3信号通路激活。另一方面，升高细胞内ATF4的水平，可以有效提高黑色素瘤细胞增殖和迁移的功能，而降低内源ATF4的水平，则可以有效抑制黑色素瘤细胞的增殖和转移。

ATF4是一種重要的转录激活因子，UPR信号通路激活后，大量表达的ATF4蛋白促进了多种基因的表达，从而缓解了内质网应激，重建内质网稳态[2，4]。而越来越多的研究发现，除调控内质网应激相关基因的表达外，ATF4还参与了调控了多种病理生理过程相关的基因表达。研究发现ATF4可以促进黑色素瘤细胞内IL-6 启动子的转录活性，增加IL-6的表达和分泌，暗示ATF4可能是参与调控了IL-6的表达，详细阐释黑色素瘤细胞中ATF4参与IL-6表达调控的分子机制仍需要更多的研究结果。

有意思的是，用IL6受体抑制剂Sarilumab可以抑制ATF4高表达造成的细胞IL-6-STAT3信号通路的激活，这一结果提示黑色素瘤细胞表达的IL-6进一步通过自分泌或旁分泌作用激活了细胞内STAT3信号通路。以往的研究发现STAT3信号通路在多种肿瘤，特别是恶性肿瘤中，都处于高度激活状态，而且在肿瘤细胞增殖和侵袭过程中都起到重要的作用[20-23]，在50%～90%的恶性黑色素瘤患者中，也发现了STAT3蛋白处于高度磷酸化状态[22]，但是其具体原因和功能并不是十分清楚。本次研究结果显示，黑色素瘤细胞内高水平的ATF4可能通过增加细胞IL-6的表达，从而提高细胞内STAT3信号通路的激活，而另一方面，增加的磷酸化STAT3可以促进黑色素瘤细胞的增殖和迁移能力，这可能是ATF4调控黑色素瘤细胞增殖和转移的（部分）分子机制。在接下来的研究中，仍需做更多的研究工作，更好地阐释ATF4促进黑色素瘤细胞增殖和转移的具体分子机制。

综上所述，黑色素瘤细胞内高表达的ATF4蛋白，具有促进黑色素瘤增殖和转移的作用，而其通过调控细胞IL-6的表达和分泌，激活细胞内STAT3信号通路的激活，从而参与调控了黑色素瘤的发生发展过程。本次研究结果对黑色素瘤的临床治疗和药物研发提供了很有价值的参考。

[参考文献]

[1]Sykes EK，S Mactier，RI Christopherson.Melanoma and the Unfolded Protein Response[J].Cancers（Basel），2016，8（3）：30.

[2]Schroder M，Kaufman RJ.The mammalian unfolded protein response[J].Annu Rev Biochem，2005，74：739-789.

[3]Todd DJ，AH Lee，LH Glimcher.The endoplasmic reticulum stress response in immunity and autoimmunity[J].Nat Rev Immunol，2008，8（9）：663-674.

[4]Walter P，Ron D.The unfolded protein response： from stress pathway to homeostatic regulation[J].Science，2011，334（6059）：1081-1086.

[5]Kim H，Bhattacharya A，Qi L.Endoplasmic reticulum quality control in cancer： Friend or foe[J].Semin Cancer Biol，2015，33：25-33.

[6]Wu Y，Shan B，Dai J，et al.Dual Role for Inositol-requiring Enzyme 1alpha in Promoting the Development of Hepatocellular Carcinoma during Diet-induced Obesity in mice[J].Hepatology，2018.

[7]Ye J，Kumanova M，Hart LS，et al.The GCN2-ATF4 pathway is critical for tumour cell survival and proliferation in response to nutrient deprivation[J].EMBO J，2010，29（12）：2082-2096.

[8]Bi M，Naczki C，Koritzinsky M，et al.ER stress-regulated translation increases tolerance to extreme hypoxia and promotes tumor growth[J].EMBO J，2005，24（19）：3470-3481.

[9]Bobrovnikova-Marjon E，Grigoriadou C，Pytel D，et al.PERK promotes cancer cell proliferation and tumor growth by limiting oxidative DNA damage[J].Oncogene，2010，29（27）：3881-3895.

[10]Igarashi T，Izumi H，Uchiumi T，et al.Clock and ATF4 transcription system regulates drug resistance in human cancer cell lines[J].Oncogene，2007，26（33）：4749-4760.

[11]Tanabe M，Izumi H，Ise T，et al.Activating transcription factor 4 increases the cisplatin resistance of human cancer cell lines[J].Cancer Res，2003，63（24）：8592-8595.

[12]Ameri K，Lewis CE，Raida M，et al.Anoxic induction of ATF-4 through HIF-1-independent pathways of protein stabilization in human cancer cells[J].Blood，2004，103（5）：1876-1882.

[13]Dey S，Sayers CM，Verginadis II，et al. ATF4-dependent induction of heme oxygenase 1 prevents anoikis and promotes metastasis[J].J Clin Invest，2015，125（7）：2592-2608.

[14]Suzuki T，Osumi N，Wakamatsu Y.Stabilization of ATF4 protein is required for the regulation of epithelial-mesenchymal transition of the avian neural crest[J].Dev Biol，2010，344（2）：658-668.

[15]Nagelkerke A，Bussink J，Mujcic H，et al.Hypoxia stimulates migration of breast cancer cells via the PERK/ATF4/LAMP3-arm of the unfolded protein response[J].Breast Cancer Res，2013，15（1）：R2.

[16]Croft A，Tay KH，Boyd SC，et al.Oncogenic activation of MEK/ERK primes melanoma cells for adaptation to endoplasmic reticulum stress[J].J Invest Dermatol，2014，134（2）：488-497.

[17]Ma XH，Piao SF，Dey S，et al.Targeting ER stress-induced autophagy overcomes BRAF inhibitor resistance in melanoma[J].J Clin Invest，2014，124（3）：1406-1417.

[18]Shan B，Wang X，Wu Y，et al.The metabolic ER stress sensor IRE1alpha suppresses alternative activation of macrophages and impairs energy expenditure in obesity[J]. Nat Immunol，2017，18（5）：519-529.

[19]Shao M，Shan B，Liu Y，et al.Hepatic IRE1alpha regulates fasting-induced metabolic adaptive programs through the XBP1s-PPARalpha axis signalling[J].Nat Commun，2014，5：3528.

[20]Ding BB，Yu JJ，Yu RY，et al.Constitutively activated STAT3 promotes cell proliferation and survival in the activated B-cell subtype of diffuse large B-cell lymphomas[J].Blood，2008，111（3）：1515-1523.

[21]Darnell JE.Validating Stat3 in cancer therapy[J].Nat Med，2005，11（6）：595-596.

[22]Kortylewski M，Jove R，Yu H.Targeting STAT3 affects melanoma on multiple fronts[J].Cancer Metastasis Rev，2005，24（2）：315-327.

[23]Kortylewski M，Kujawski M，Wang T，et al.Inhibiting Stat3 signaling in the hematopoietic system elicits multicomponent antitumor immunity[J].Nat Med，2005，11（12）：1314-1321.

[收稿日期]2018-04-28 [修回日期]2018-05-28

編辑/朱婉蓉