IL-6、STAT3及P-STAT3在口腔黏膜下纤维性变各期中的表达研究*

李鹏程,郑根建,云 蔓,何 龙

(海南医学院第一附属医院口腔科，海口 570102)

口腔黏膜下纤维性变又称口腔黏膜下纤维化(oral submucous fibrosis，OSF),是一种慢性、隐匿性、具有癌变倾向的口腔黏膜疾病[1]。OSF主要病理特征包括早期黏膜固有层及黏膜下层胶原纤维堆积，随后形成致密的胶原纤维束，晚期伴不同程度的玻璃样变及上皮组织萎缩。OSF的具体发病机制并不明确，但咀嚼槟榔导致成纤维细胞纤维化、自身免疫反应等因素是目前国内外公认的致病因素之一。OSF最大的危害在于具有癌变倾向，WHO已将OSF定义为癌前病变[1-4]。

1 资料与方法

1.1一般资料 根据pindborg病理学标准收集海南医学院第一附属医院2016年1月至2017年12月就诊且确诊的35例OSF患者，由3名病理科医师光镜下对病例进行分期，其中早期9例、中期14例、晚期12例。同时选择正常口腔黏膜组织35例，组织样本采集均经过海南医学院第一附属医院伦理学委员会批准，患者均签署知情同意书。患者性别、年龄见表1。各期诊断标准，OSF早期：口腔黏膜有烧灼感，进食时有刺激痛，检查见局灶性或散在性口腔黏膜灰白色改变，质地无改变或粗糙，开口度大于或等于30 mm;OSF中期：进刺激性食物时口腔黏膜疼痛，黏膜颜色呈片状灰白色改变，质地变硬，翼下颌韧带及软腭扪及纤维条索，张口度为20～30 mm;OSF晚期：进刺激性食物时口腔黏膜疼痛，黏膜颜色呈灰白色改变，质地变硬，扪诊呈板状或皮革样，舌运动受限，伸舌困难，病变侵及口咽及咽喉部，张口度小于20 mm。

1.2试剂 OSF临床标本均由海南医学院第一附属医院口腔科提供，胎牛血清购自美国PAA公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、 荧光定量PCR试剂盒均购自日本Takara公司，IL-6、STAT3、p-STAT3兔单克隆抗体均购自美国Abcam公司，寡核苷酸链由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所用的寡核苷酸序列见表2。

表1 患者性别、年龄及分期

表2 引物序列

1.3方法

1.3.1免疫组织化学 将两张OSF切片常规脱蜡至水，常温下滴加3%过氧化氢甲醇溶液于标本切片上孵育10 min，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS液在摇床上洗3次，每次2 min；将两张切片置于盛有枸橼酸溶液的高压锅内加热，待高压锅排气管排气后调低火，继续加热2 min，自然冷却至室温，PBS液在摇床上洗3次，每次2 min；5%BSA封闭液室温孵育30 min，以减少一抗非特异性结合；分别加入兔来源的IL-6、STAT3一抗(1∶200)，4 ℃过夜，PBS液摇床上洗3次，每次2 min；标本切片上滴入生物素化山羊抗兔二 抗，37 ℃恒温箱内孵育30 min，PBS液摇床上洗3次，每次2 min；加入链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物室温下孵育20 min，PBS洗3次，每次3 min；DAB显色2～3 min，自来水冲洗，苏木素复染标本切片6 s；切片经梯度乙醇脱水干燥，并经二甲苯透明后中性树胶封固。棕褐色反应物颗粒状或弥散性分布在细胞核为IL-6、STAT3、P-STAT3阳性表达。

1.3.2RT-PCR测定 因患者病理分期数目不同，无法取统一整数比较，故取正常组织9例及早、中、晚期OSF 组织各9例(共27例)，用Trizol一步法提取组织中的总RNA，Qubit Fluorometer检测RNA水平及纯度，按反转录试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA,用RT-PCR检测相关基因。

1.3.3Western blot 取正常组织4例及早、中、晚期OSF 组织各4例(共12例)，RIPA裂解液裂解混匀，4 ℃ 16 000 r/min离心20 min，吸取上清液弃沉淀，考马斯亮蓝法检测组织样本蛋白浓度，样本凝胶电泳后浸泡于转移缓冲液中15 min，装配转移“三明治”120 V，35～55 min，用TBS漂洗膜10～15 min，置于封闭液中室温摇动2 h，4 ℃过夜，之后常规加入IL-6、STAT3、P-STAT3一抗室温孵育2 h，与之相应的兔抗人二抗室温孵育1 h。采用Quantity One v4.62软件分析条带灰度值，并做统计分析。

2 结 果

2.1免疫组化 OSF患者免疫组化染色切片显示，OSF组织内可见呈棕褐色的STAT3、IL-6、P-STAT3阳性细胞(图1)。

2.2RT-PCR IL-6及P-STAT3在各期OSF组织中的mRNA表达量OSF晚期最高(P<0.05)；STAT3在对照组及各期OSF组织中的表达量，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

2.3Western blot IL-6及P-STAT3在各期OSF组织中的蛋白表达灰度值较对照组织显著升高，STAT3在各期OSF组织中的蛋白灰度值较对照组无明显变化，见图3。

A：OSF STAT3阳性细胞(棕褐色)；B:OSF IL-6阳性细胞(棕褐色)；C:OSF P-STA3阳性细胞(棕褐色)；D:阴性细胞

图1 OSF结缔组织免疫组化染色切片

a：P<0.05

图2 STAT3、IL-6、P-STAT3 mRNA表达差异分析

图3 STAT3、IL-6、P-STAT3蛋白表达情况

3 讨 论

口腔黏膜下纤维性变主要的临床症状有口腔黏膜苍白、僵硬，张口受限，不能进食热、辣食物等，突出的病理特征是口腔黏膜固有层大量胶原堆积。上皮下胶原的过度累积和玻璃样变是OSF患者口腔黏膜发生不可逆改变并致张口困难的重要原因和重要特征之一，其本质是成纤维细胞和肌纤维母细胞等产生胶原蛋白等过多沉积于黏膜上皮下所致，如何防止这一过程的发生和发展仍是当今OSF治疗的重大挑战[5]。但是黏膜下纤维化是一个极其复杂的病理生理过程，迄今为止关于OSF上皮损伤、胶原的过度沉积和血管病变形成和发展机制尚不明确，导致没有直接针对OSF有效的治疗方法。因此探索其形成机制和阻断办法具有重要的理论和实际意义。由于OSF发生、发展的机制尚不明确,使得OSF在过去30年中尝试的大多数化学预防性或其他系统性医疗方法仍然是不佳的。OSF当前的治疗方法可分为3种：物理治疗、手术治疗和药物治疗，但是治疗效果都无法令人满意。单纯的营养补充或行为干预，对纤维化程度没有任何改善[6-9]。

白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是一种主要由单核巨噬细胞、静止的T细胞、B细胞等产生的具有多种生物功能、广泛免疫调节功能的细胞因子[10-11]，它在许多疾病中都被检测到表达升高，如：类风湿关节炎、银屑病、自身免疫性疾病等[12-13]。IL-6作为一种细胞趋化因子，其中主要参与机体的纤维化形成和炎性反应，其抑制细胞外基质分解，使胶原蛋白聚集增加，促进成纤维细胞增殖，从而使组织纤维化。

STAT3属于STAT家族(signal transducer and activator of transcription factors)重要成员之一，即信号转导及转录活化因子3，STAT3功能结构域主要包括：N-末端结构域、螺旋-螺旋结构域、DNA结合结构域、连接子结构域、SH2结构域及C-末端的激活区[14]。SH2结构域是STAT3最保守和功能最重要的部分，主要介导STAT3与其他磷酸化酪氨酸蛋白的耦联，形成STAT3二聚体，从而激活该通路[15]。细胞因子如IL-17与跨膜受体结后，激活受体耦联的JAK，在STAT3与磷酸化的受体结合后，诱发STAT3的C-末端Tyr-705磷酸化[16]。磷酸化的STAT3从受体上解离，并通过SH2结构域相互作用，形成P-STAT3二聚体，P-STAT3二聚体与PIAS结合阻断P-STAT3二聚体与DNA结合部位，进而负反馈调控STAT磷酸化作用[17]。近年来有研究报道，磷酸化的STAT3(p-STAT3)的异常表达在银屑病发生中起重要作用，并认为与黏膜或皮肤的纤维化等行为相关。

本研究通过免疫组化、RT-PCR、Western blot对正常口腔黏膜组织及各期OSF组织中的IL-6、STAT3、P-STAT3进行检测，免疫组化实验表明在口腔黏膜发生纤维性变的结缔组织内IL-6、STAT3呈阳性表达，RT-PCR及Western blot实验表明，IL-6、P-STAT3在OSF组织中早期、中期表达较正常黏膜组织无显著升高，晚期较正常黏膜组织表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，STAT3在各期OSF组织中表达较正常组织无显著升高，差异无统计学意义(P>0.05)。

综上所述，在OSF组织中，IL-6的表达随着病变从早期向晚期的发展呈显著性升高，然后诱导下游信号通路分子STAT3的磷酸化，即P-STAT3表达增加，由此说明，IL-6可以通过激活信号通路STAT3的磷酸化同时促进口腔黏膜组织纤维化由早期向晚期的转变，该结果表明，IL-6和P-STAT3在OSF发生、发展过程中可能起到促进的作用，这为临床治疗OSF提供了新的关键靶点。