多孔纳米羟基磷灰石的制备及药物缓释性能

刘露露，钱功明，徐作行

（武汉科技大学资源与环境工程学院，湖北武汉 430081）

与直接给药相比，药物缓释具有副作用小，有效作用时间长等优点，也一直是医药领域的研究热点[1，2-5]。药物缓释剂由药物和药物载体制备而成，而药物载体对药物缓释剂的缓释性能起决定作用。常用于制备药物载体的材料有合成高分子有机材料、壳聚糖、胶原材料、纳米纤维素载体、二氧化钛-二氧化硅无机材料等[6，7-8]，其中无机材料具有很好的药物负载能力，但生物相容性差。

羟基磷灰石（HAP）是生物体硬组织的主要组成部分，具有良好的生物相容性、强吸附能力、高生物降解能力、安全无毒等优点，适合用作药物载体。而HAP作为药物载体是目前的研究热点[9，10-11]。已有研究发现，比表面积越大、孔隙越多HAP的HAP负载和药物缓释效果越好[12-13]，因此，制备高比表面积多孔HAP是目前HAP药物载体的发展趋势。

为了制备药物负载性能与药物缓释性能良好的HAP，采用羧甲基纤维素钠（CMC）作为模板剂，制备高比表面积的三维多孔纳米HAP，并考察陈化温度、磷源溶液的初始pH等因素对HAP形貌结构及其成分的影响；并用制备得到的HAP作为药物载体制备AM-HAP药物缓释剂，进行体外缓释，考察PBS溶液的pH对AM-HAP缓释行为的影响，并对药物缓释机理进行分析。

1 实验

1.1 原料与仪器

实验用主要试剂：硝酸钙（Ca（NO3）2）、磷酸二氢铵（NH4H2PO4）、浓氨水（NH3·H2O）、CMC（C8H11O5Na）、氢氧化钠（NaOH）、浓盐酸（HCl）、AM（C16H19N3O5S·3H2O）、 磷酸氢二钠（NaHPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）等，均为分析纯。实验中所用的水均为蒸馏水。

实验用仪器设备：UV-1100型紫外-可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；FA-1004型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱、HJ-4型多头磁力加热搅拌器，江苏常州国华电器有限公司；SZ-93型自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；800低速电动离心机，金坛市易晨仪器制造有限公司；X射线衍射（XRD）仪，XD-5A型，日本岛津，Cu靶Kα，管电压为35 kV，管电流为35 mA，接收狭缝为0.3 mm；扫描电镜（SEM）和X射线能谱（EDS）仪，JSM-5510型，日本岛津；马弗炉，武汉电庐实验电炉厂。

1.2 HAP制备方法

使用蒸馏水配置浓度为1 mol/L硝酸钙溶液、0.6 mol/L磷酸二氢铵溶液和质量浓度为6 g/L的羧甲基纤维素钠溶液。将250 mL的CMC溶液加入球磨机中球磨30 min；再继续向球磨机中加入75 mL的硝酸钙溶液，球磨30 min，即得混合液；将此混合液从球磨机移入500 mL烧杯中，在磁力加热搅拌器中边搅拌边缓慢向混合液中加入75 mL磷酸二氢铵溶液与不同体积的浓氨水的混合溶液，得HAP的前驱体；将前驱体从烧杯移入球磨机，球磨30 min，从球磨机中移入封闭容器内，在不同温度下陈化24 h后放入离心机中固液分离，放入烘箱干燥48 h后，在700℃条件下焙烧处理2 h。

1.3 AM-HAP制备方法

将AM溶于浓度为0.1 mol/L的盐酸溶液，配置成AM溶液，并调节溶液pH为10。取50 mLAM溶液于250 mL烧杯中，加入0.05 g以1.2所述方法制备的HAP，搅拌一段时间，离心后常温干燥，即可得到AM-HAP。

1.4 AM-HAP的体外缓释实验方法

用蒸馏水配置PBS溶液，分别取15 mL不同pH的PBS溶液于离心管中，然后向其中加入0.02 g AM-HAP，在37℃条件下，每间隔一定时间，从离心管中取出3 mL上清液，并立即向其中补充加入3 mL相对应pH的PBS溶液，采用紫外分光光度法测定上清液中AM的浓度。

2 结果与讨论

2.1 陈化温度对HAP形貌结构的影响

在焙烧温度为700℃，焙烧时间为2 h，升温速度为10℃/min，CMC与HAP的质量比为20%，加入的磷酸二氢铵溶液的pH为10.2，其他实验条件相同的条件下，改变陈化温度，分别在 284.16、303.16、333.16、353.16 K条件下进行陈化，探讨陈化温度对HAP的结构及成分的影响。图1为不同陈化温度下HAP的XRD图谱。

图1 不同陈化温度下HAP的XRD图谱Fig.1 XRD patterns of HAP of different aging temperature

由图1可以看出，陈化温度为284.16 K时，产物的主要成分为HAP和磷酸钙（Ca3（PO4）2，TCP），含杂质较多，其中TCP的衍射峰尖锐，HAP的衍射峰较宽；陈化温度为303.16、333.16、353.26 K时，产物的主要成分为纯HAP，衍射峰较宽且基本没有变化，由此可知HAP结晶度不高，而陈化温度对HAP的结晶度影响不大。综上所述，当陈化温度较低为284.16 K时，有杂质TCP生成，而陈化温度较高时，则生成纯的HAP。分析其原因是：NH3·H2O是弱电解质，电离吸热，电离式如式（1）所示[15]，当温度降低时，平衡向左移动，溶液中OH-离子浓度下降，合成溶液的碱性度降低，从而参与HAP合成反应的OH-离子不足，生成杂质Ca3（PO4）2。因此，陈化温度对HAP的化学组成有很大影响，温度过低时，有Ca3（PO4）2杂质生成。

图2为不同陈化温度下反应前后溶液的pH。由图可以看出，溶液的初始pH均为10.2。当陈化温度为301.16 K时，陈化后溶液的pH为9.37～9.44；而当陈化温度为294.16 K时，陈化后溶液的pH为9.55～9.66。由此可知，陈化温度对陈化后溶液的pH有很大影响，陈化后溶液的pH随陈化温度的升高而减小。而从图1已知，陈化温度低时，弱电解质NH3·H2O的电离平衡向左移动，参与HAP合成反应的OH-离子浓度下降。

综上表明，陈化温度降低，NH3·H2O电离平衡向左移动，参与反应的OH-离子浓度下降，因此陈化温度降低时陈化后溶液中OH-离子的残余浓度增大，即陈化温度降低，陈化后溶液pH增大。除以上原因外，陈化后溶液pH随温度升高而减小的原因还可能是：温度升高，NH3·H2O以氨气（NH3）的形式挥发了，但由于陈化容器有一定密闭性，因此这一因素对pH的影响较弱。综上，陈化温度会影响HAP的化学组成，温度降低时，参与反应的OH-离子浓度下降，生成杂质TCP，反应后溶液中残余的OH-离子浓度升高，溶液pH增大。

图2 不同陈化温度下反应前后溶液的pHFig.2 pH of solution before and after experiments of different aging temperature

图3 为不同陈化温度下HAP的SEM图像。图4为不同陈化温度下HAP的粒径。由图可以看出，不同陈化温度下，HAP均为三维多孔结构，而HAP的粒径在不同的陈化温度时有很大变化。由图4可以看出，随着陈化温度的升高，HAP的粒度逐渐变小。陈化温度为284.16 K时，颗粒粒径为249.55 nm，而当温度升高到353.16 K时，颗粒粒径减小为64.84 nm。这是因为：温度对CMC的性能有很大影响[14]，CMC的溶胀性随温度的升高而增大。CMC在温度293.16 K以下时，溶胀性会迅速减小，而在温度353.16 K时可使其CMC胶体变性，溶胀性显著增大，而CMC溶胀性变大会导致HAP生长的空间位阻增大。

结合图3和图4分析，温度为284.16 K时，CMC溶胀性低，CMC分子空间位阻小，其分子间的空隙大，HAP生长成大尺寸的片状，如图3a所示；温度为301.16、303.16 K时，CMC溶胀性较好，空间位阻较大，其分子间的空隙较小，HAP生长成小尺寸的棒状、支架状，如图3b、c所示；当温度过高，为333.16、353.16 K时，CMC胶体变性，溶胀性显著增大，CMC分子空间位阻过大，分子间的空隙过小，HAP生长成小尺寸的粒状并且发生团聚，如图3d、e所示。

图3 不同陈化温度下HAP的SEM图像Fig.3 SEM of HAP of different aging temperature

图4 不同陈化温度下HAP颗粒的粒径Fig.4 size of HAP of different aging temperature

2.2 pH对HAP形貌结构的影响

在焙烧温度为700℃，焙烧时间为2 h，升温速度为10℃/min，CMC与HAP的质量比为20%，且加钙源后球磨时间为30 min，反应及陈化温度为301.16 K，其他条件相同的条件下，改变磷酸二氢铵溶液的 pH，pH 分别为 9.2、9.6、10.0、10.2。探讨 pH对HAP形貌结构的影响，图5为不同初始pH的HAP的XRD图谱，表 1为不同初始pH时HAP的化学组分。

综上所述，增强MRI对结直肠癌患者发生淋巴结转移的检出率及诊断准确率较高，可有效显示结直肠癌MRI图像特征，为临床制定治疗方案提供影像学资料。

表1 不同pH制备的HAP的化学组分Tab.1 chemical constitution of HAP of different initial pH

从图5可以看出，pH为10.2时，产物的成分为HAP，不含其他副产物，衍射峰较宽，结晶度不高；而pH小于10.2，pH为10.0、9.6和9.2时，得到的主要产物为HAP和TCP，副产物含量较高，其中TCP的衍射峰尖锐，HAP的衍射峰较宽。

图5 不同初始pH下HAP的XRD图谱Fig.5 XRD spectrum of HAP of different initial pH

从表1可以看出，当pH为9.2时，TCP的质量分数为48%；pH为10.2时，TCP的含量为0时。TCP的含量随pH的增大而减小，当pH达到10.2时，成品为纯HAP。分析其原因为：当pH小时，参与HAP合成反应的OH-离子不足，到反应后期，反应溶液从碱性变成酸性，反应生成TCP；而随着pH的增大，参与HAP合成反应的OH-离子增多，反应生成的副产物TCP逐渐减少；当pH为10.2时，反应溶液始终保持在碱性状态下，因此没有副产物生成，生成物为纯的HAP。图6所示为不同pH条件下陈化后溶度的pH。

图6 不同pH条件下陈化后溶液的pHFig.6 pH of the solution of different initial pH after aging

从图6可以看出，当pH为9.6和9.2时，陈化后溶液的pH小于7，这表明pH较小时，HAP合成反应后期，钙磷溶液处于酸性环境中，生成TCP。而当pH为10.0时，陈化后溶液的pH为8.5，即OH-离子浓度为10-5.5mol/L，这说明在HAP合成反应过程中，反应溶液始终处于碱性环境中，但此时仍然生成了19%的TCP。分析可能的原因是：OH-离子浓度较小时，Ca2+、PO43-和OH-的溶度积小于HAP的溶度积常数Ksp1，不能生成HAP，而 Ca2+和PO43-的浓度积大于TCP的溶度积常数Ksp2，因此生成了副产物TCP，如式（2）和（3）所示。由此可知，当反应溶液始终处于碱性环境，且 Ca2+、PO43-和 OH-浓度关系始终满足式（4）和（5）时，生成纯HAP，没有副产物。即当pH为10.2时，陈化后的pH为9.4，当OH-的浓度为10-4.6mol/L时，Ca2+、PO43-和 OH-的浓度关系始终满足式（4）和（5），合成产物为纯HAP。

式中，C 表示物质的量浓度，Ksp1、Ksp2分别为 TCP、HAP的浓度积常数。

为进一步探究pH对HAP的形貌的影响，对制得的HAP进行扫描电镜，图7为不同pH条件下HAP的SEM图像，图8为不同pH条件下HAP的粒径。

从图7中可看出，pH为9.2和9.6时，产物粒度不均匀；pH为10.0和10.2时，合成的产物粒度均一。pH为9.6、10.0和10.2时，合成的产物互相连接在一起，形成多空隙的架状结构。其中pH为9.6和10.0时，产物为大尺寸的块状和片状，且颗粒互相团聚连接成一个整体；而pH为10.2时，HAP为细长的棒状，棒与棒互相连接成多孔的三维结构。

图7 不同pH条件下HAP的SEM图像Fig.7 SEM of HAP of different initial pH

图8 不同PH条件下HAP的粒径Fig.8 size of HAP of different initial pH

从图8可以看出，pH为9.6和9.2时HAP的粒径较大，分别为334、240 nm，且粒度尺寸非常不均一，小颗粒尺寸分别为108、101 nm。而pH为10.0和10.2时，HAP的粒径均一，粒径较小，分别为129、134 nm。出现这种情况的原因是：溶液的pH对CMC的溶胀性影响很大。当pH为7时，相同浓度下CMC溶液的溶胀性最低，并且CMC溶液在酸性环境时的溶胀性比在碱性环境中的溶胀性低。而CMC的溶胀性越大，空间位阻增大，合成的HAP粒径越小，而由图8可知，pH为9.6和9.2时，陈化后溶液的pH分别为7和5，在此pH下CMC溶液溶胀性低，合成的HAP粒径大；而溶液初始pH为10.0、10.2时，陈化后溶液的pH为8.3、9.5，此时CMC溶液溶胀性大，因此合成的HAP粒径小。

2.3 PBS溶液的pH对AM-HAP缓释行为的影响

图9 不同pH的PBS溶液下AM-HAP的缓释Fig.9 relationship between the concentration of AM and the reaction time in the pH 7.4 and pH 5.7 of PBS liquid

表2 不同pH条件下PBS溶液中AM的脱附率Tab.2 desorption efficiency of AM in different pH of PBS liquid

由表2可知，AM的脱附率随着PBS溶液pH的降低而增大，由此可知AM-HAP有一定的选择脱附能力。从图9可以看出，在pH为7.4时，从缓释初期开始AM浓度始终维持在一个稳定的范围，在1 mg/L左右浮动。而当缓释时间达到150 h时，AM浓度开始下降，缓释行为结束，此时AM的脱附率为56.6%。而在pH为5.7时，AM的浓度随缓释时间的延长呈M型变化。在缓释前1.5 h内AM浓度随时间的延长而增大，并且在此过程中AM的脱附率达到48.3%；在1.5～10 h，AM的浓度持续降低；在10～24 h时，AM的浓度随时间延长而增大，并且在之后的24～190 h，AM的浓度始终保持稳定，在1.5～2.5 mg/L左右浮动，且缓释结束后，AM的总脱附率达到92.8%。

综上可知，AM-HAP有选择性缓释性能，与pH为7.4时的PBS溶液中缓释相比，在pH为5.7时的PBS溶液中，AM的脱附率达到92.8%，且能够长时间维持AM浓度在一个稳定的范围。这是因为，pH为5.7时，溶液中的H+离子浓度高，而AM与HAP的结合是通过AM分子中的羧基脱去H+，AM中的带负电荷官能团静电吸附在HAP的特殊吸附点位上，因此H+离子浓度的增大会促使AM中的—COO-与H+离子结合成—COOH，从而使AM从HAP的吸附位点上脱附并进入PBS溶液中，提高AM的浓度。而AM浓度随时间呈M型变化则是因为：缓释前期，吸附在HAP表面和表面孔隙中的AM由于H+的促进作用，很容易脱附进入溶液，因此在前期1.5 h的AM脱附率就与pH为7.4时的总脱附率相差不大。这说明pH为7.4的整个缓释过程和pH为5.7缓释的前1.5 h，均属于HAP表面和表面孔隙中的AM的脱附；而pH为5.7时的缓释后期AM的浓度又开始升高并维持稳定，则是因为HAP的表面结构在酸性环境中溶解，使HAP内层结构暴露于表面，且负载在其中的AM也随之脱附进入溶液，AM浓度增大并维持稳定。综上所述，pH为5.7时的PBS溶液中缓释过程为：HAP表层AM脱附—HAP表面溶解—HAP内层AM脱附。

为进一步研究PBS溶液的pH对AM脱附的影响，证明以上结论，对缓释后的残余固体做扫描电镜和能谱，如图10所示，为缓释后AM-HAP残余固体的SEM图像和EDS能谱图。

由图10可以看出，缓释结束后，pH为5.7时AM-HAP表面明显发生溶解，如图10a所示，HAP表面凹凸不平。这是因为HAP与溶液中的H+反应，HAP表面溶解，进一步证明PBS溶液的pH为5.7时的缓释过程中，HAP表面溶解是重要步骤。如图10c—f所示，缓释后HAP表面specterm1的位置为溶解后的表面，其能谱图中没有C元素的峰，这说明HAP表面溶解后AM脱附完全；而specterm2的位置为HAP表面尚未溶解或溶解较弱的位置，如10f所示，有较强的C元素峰出现，说明此处还有少量未脱附的AM。而如图10b所示，pH为7.4的反应后残余固体表面基本没有发生溶解。

图10 缓释后AM-HAP残余固体的SEM图像和EDS能谱图Fig.10 SEM and EDS of the final residual solid of AM-HAP after reaction

3 结论

采用模板法制备三维多孔纳米HAP，陈化温度和溶液的初始pH对HAP的形貌、结构和化学组成有很大影响。陈化温度升高，NH3·H2O电离平衡向右移动，参与反应的OH-离子增多，生成纯HAP。而陈化温度降低，参与反应的OH-离子不足，生成杂质TCP。CMC的溶胀性随陈化温度的升高而增大，因此陈化温度越高，HAP的粒径越小。溶液的初始pH小于10.2时，参与HAP合成反应的OH-离子不足，生成杂质TCP；而当初始pH为10.2时，生成纯的HAP。溶液酸碱度对CMC的溶胀性有很大影响，碱性时CMC的溶胀性比酸性时的溶胀性大。因此pH为9.6时，HAP为片状粒径为334 nm，而pH为10.2时，HAP为细长棒状长为134 nm。

以本文中的制备方法制备的HAP作为药物载体，制得的AM-HAP具有很好的缓释性能及选择性脱附性能。在pH为7.4的PBS溶液中能持续缓释150 h，并且AM的浓度维持稳定，AM的总脱附率为56.6%。pH为7.4时的PBS溶液中缓释过程为：AM中的—COO-与H+离子结合成—COOH，从而使AM从HAP的吸附位点上脱附并进入PBS溶液；在pH为5.7的PBS溶液中，AM的浓度随缓释时间的延长呈M型变化，缓释前1.5 h的AM的脱附率就达到48.3%。pH为5.7时的PBS溶液中缓释过程为：HAP表层AM脱附—HAP表面溶解—HAP内层AM脱附。