五株鸡滑液囊支原体的分离与鉴定

马爽 于国营 范根成 郭莉莉 赵鹏 宫晓 宋新宇

摘要：从12份鸡滑液囊支原体临床病料中分离到5株支原体，经形态特性、生化特性、培养特性、分子生物学特性鉴定，5株支原体均为鸡滑液囊支原体。活菌计数结果表明，HN3株菌液的活菌数相对较高，为109 CCU/mL；毒力试验结果表明，5株鸡滑液囊支原体对45日龄SPF鸡的发病率为50%～90%，HN3株毒力相对最高，为90%。

关键词：鸡滑液囊支原体；分离；鉴定

中图分类号：S852.62 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）14-0099-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.14.023 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Five strains of Mycoplasma synoviae were isolated from twelve suspected samples with clinical symptoms of Mycoplasma synoviae infection.Morphologic observation，biochemical test and molecular biological analysis were used to identify these strains. The results showed that the five strains were all Mycoplasma synoviae. Live bacteria counting results showed that Strain HN3 had highest number of living bacterium，109 CCU/mL. Virulence test results showed that morbidities of five strains to 45 days-old SPF chicken were 50%～90%. Strain HN3 had highest morbidity， was 90%.

Key words： Mycoplasma synoviae； isolation； identification

鸡滑液囊支原体病是由鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）引起的鸡和火鸡的一种急慢性传染病，不同菌株的致病性有所不同[1]，能够引起亚临床型上呼吸道感染[2]以及关节炎和传染性滑膜炎的发生，导致生长发育迟缓及胴体降级，甚至会激发免疫系统的抑制[3]。该病一年四季均可发生，但以春冬季节易发，各种日龄鸡只均易感，多见于1～4月龄鸡，发病率一般为5%～15%，死亡率约为1%～10%。雏鸡易感性比成年鸡要高，抵抗力随年龄的增长而加强，MS除了水平传播外，还可以发生垂直传播[4]。国内外多个地区均存在MS的感染，并且近年来该病有发展及蔓延趋势，给养殖业带来较大的经济损失[5]。

本研究从12份临床病料中进行了病原分离，其中分离到5株支原体，并对这5株支原体进行了鉴定，为下一步研究提供了数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验对象 病料来自吉林、河南、山东、陕西、广东等地发病养鸡场，采集肿胀跗关节、足掌部和龙骨滑液囊囊肿等。45日龄SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.1.2 参考菌株 鸡滑液囊支原体参考株WVU1853株和鸡毒支原体参考株R株均购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 培养基 改良CM液体和改良CM固体培养基均由动物基因工程疫苗国家重点实验室制备。

1.1.4 引物 根据GenBank中收录的鸡滑液囊支原体VlhA基因，针对保守区设计引物，由宝生物工程（大连）有限公司合成。鸡滑液囊支原体特异性引物：F：5-GCCATTGCTCCTGCTGTTATA-3；R：5-GGGTAGTCCACTCGCATT-3。鸡毒支原体特异性引物：F：5-GGATCCCATCTCGACCAGGAGAAAA-3；R：5-CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA-3。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離 取肿胀跗关节、足掌部及龙骨滑液囊内容物，接种于改良CM液体培养基，置37 ℃，振荡培养，待接种后的改良CM液体培养基颜色由猩红变成橘黄时收获并传代，取第2代菌液进行鉴定。

1.2.2 病原菌鉴定

1）形态观察。将分离株经吉姆萨染色后镜检，观察菌体形态。

2）生化特性。将分离株分别进行葡萄糖、麦芽糖、乳糖发酵试验及精氨酸分解试验，细菌L型鉴定，鸡红细胞凝集鉴定试验[6]。试验中同时用WVU1853株作对照。

3）培养特性。将分离株分别接种于含辅酶Ⅰ和不含辅酶Ⅰ的改良CM液体培养中，观察在液体培养基中的生长情况；将分离株分别接种于含有辅酶Ⅰ和不含辅酶Ⅰ的改良CM固体培养基上，置于5%的CO2培养箱，37 ℃培养3～5 d，置低倍镜下观察菌落形态[7]。

4）活菌计数（CCU/mL）。将分离株菌液分别用改良CM液体培养基以10倍浓度梯度稀释至10-10，置37 ℃，振摇培养7 d，记录每管颜色变化（以培养基颜色由猩红变成橘黄的最终管作为活菌的最高浓度），测定各分离株菌液的活菌数。

5）分子生物学鉴定。将分离株煮沸制备DNA模板[8]，分别用鸡滑液囊支原体特异性PCR引物和鸡毒支原体特异性PCR引物进行鉴定。

6）毒力试验。取分离株原菌液进行攻毒，爪垫注射[9]45日龄SPF鸡各10只，每只0.2 mL，观察14 d内攻毒鸡发病情况。

2 结果与分析

2.1 病原分离情况

对12份临床病料进行了病原分离，从其中5份病料中分离到支原体，分别命名为JL2、HN3、SX1、SD3、GD2。

2.2 形态特性和生化特性

鸡滑液囊支原体分离株（无其他病原污染的5株，下同）經吉姆萨染色，形态均为多形态的球状菌。在改良CM液体培养基中，均能发酵葡萄糖及麦芽糖，产酸不产气；不发酵乳糖，不能分解精氨酸；细菌L型鉴定均为阴性；均可凝集鸡的红细胞，结果见表1。

2.3 培养特性

5株分离株在含有辅酶Ⅰ的改良CM液体培养基中均生长良好，培养24～48 h，呈轻度浑浊生长，培养基颜色由猩红变成橘黄；在含有辅酶Ⅰ的改良CM固体培养基上培养3 d，在低倍镜下可见圆形、隆起，表面光滑的菌落，典型菌落呈煎蛋状。5株分离株在不含有辅酶Ⅰ的液体和固体培养基中均不生长。

2.4 活菌计数

结果（表2）表明，5株分离菌的活菌数为107～109 CCU/mL，以HN3株的活菌数相对最高，为109 CCU/mL。

2.5 分子生物学鉴定

用鸡滑液囊支原体特异性引物进行PCR扩增，结果5株分离株均能扩增出约773 bp的特异性片段，结果见图1。用鸡毒支原体特异性引物进行PCR扩增，结果鸡毒支原体R株扩增出约732 bp的特异性片段，5株分离株均未扩增出特异性片段，结果见图2。结果表明，5株分离株均为鸡滑液囊支原体。

2.6 动物回归试验

结果（表3）表明，5株分离株对45日龄SPF鸡均具有不同程度的致病性，发病率为50%～90%，发病鸡临床主要表现为攻毒爪不敢着地，趾关节肿胀，足掌部肿胀，个别发病鸡跗关节肿胀，引起趴卧和跛行。

3 讨论

近年来，鸡滑液囊支原体在中国广泛流行，对禽业养殖带来很大威胁，造成比较严重的经济损失。青岛易邦生物工程有限公司对中国6个地区11个省养殖场的调查研究[10]发现，该病在中国6个地区11个省份均有发生，鸡滑液囊支原体感染鸡群多见于1～4月龄，平均发病日龄为62日龄；发病率为5.75%～25.77%，6个品种鸡（海兰褐、海兰白、罗曼、白羽肉种鸡、AA肉种鸡及三黄鸡）的平均发病率为13.92%；死亡率为4.09%～15.68%，平均死亡率为9.79%；发病率和死亡率均存在地区差异。血清学检测结果表明，血清阳性率为30.23%～54.67%。鸡滑液囊支原体的发病率呈现逐年上升的趋势，表明该病在中国鸡群中有发展及蔓延的趋势，应引起养殖界和研究者的高度关注。

参与文献：

[1] 曹中赞，栾新红，刘胜旺，等.禽滑液囊支原体研究进展[J].动物医学进展，2012，33（11）：113-117.

[2] OLSON N O，ADLER H E，DAMASSA A J，et al. The effect of intranasal exposure to Mycoplasma synoviae and infectious bronchitis on development of lesions and agglutinins[J].Avian Dis，1964，8（4）：623-631.

[3] LANDMAN W J，FEBERWEE A. Longitudinal field study on the occurrence of Mycoplasma synoviae in Dutch turkey flocks with lameness and experimental induction of the condition[J]. Avian Pathol，2012，41（2）：141-149.

[4] 宋战胜.鸡滑液囊支原体病发病情况调查及诊治[J].中国家禽，2009，31（12）：51-52.

[5] BLANCHARD H，BROWNING G. Mycoplasma：Moleoularbiology，Pathogencity and Strategies for Control[M].Boca Raton：CRC Press，2005.

[6] 郭建华，陈德威，霍乃蕊，等.鸡滑液囊支原体的分离与鉴定[J].中国家禽，1998，20（6）：21-22.

[7] 丁美娟，张小飞，尹秀凤，等.鸡滑液囊支原体的分离和鉴定研究[J].中国家禽，2012，33（24）：27-29.

[8] 李桂喜，闫爱萍，王珍珍，等.鸡滑液囊霉形体的流行病学调查及其防治[J].中国动物传染病学报，2013，21（5）：45-50.

[9] 李桂喜，周勇岐，卢卫东，等.一株鸡滑液囊支原体的分离与鉴定[J].兽医导刑，2012（1）：71-72.

[10] 马 爽，郭莉莉，宋新宇，等.鸡滑液囊支原体感染的流行病学调查与分析[J].中国家禽，2016，38（23）：68-71.