小脑锌指结构5在结肠癌中的蛋白表达及预后评估价值

陆峰，刘成宸，陈威鹏，颜勋，韩玮

（1.滨海县人民医院普外科，江苏盐城224000；2.江苏大学附属昆山医院普外科，江苏昆山215300）

虽然目前手术根治已成为结肠癌的主要治疗手段，但术后患者5年生存率并不满意。因此，探索可靠的生物学指标对结肠癌患者手术根治后进行随访和评估有着积极的作用［1］。小脑锌指结构5（zinc finger protein of the cerebellum 5，ZIC5）是 ZIC家族的重要成员，其表达的ZIC5蛋白相对分子质量为68.4 kDa，主要在神经系统发育中发挥作用［2］。最近，相关文献报道，ZIC5基因在非小细胞肺癌中发挥着癌基因的作用［3］。本实验旨在通过免疫组织化学法检测ZIC5蛋白在结肠癌组织中的表达，分析其表达水平与患者的临床病理参数的关系以及ZIC5蛋白对预后的评估价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集从2010年1月至2012年12月于滨海县人民医院普外科行结肠癌根治术的76例患者切除的组织标本。所有术后病理组织均由两名高年资病理学医师确认诊断，且每例组织均包含癌组织及对应癌旁组织。所有病例均包含完整临床病理资料及预后资料，所有患者术前均未接受任何放化疗处理。其中，男34例，女42例，平均年龄为（54.8±14.8）岁，随访时间为3～60个月。

1.2 主要试剂

兔抗人ZIC5蛋白多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；免疫组织化学检测试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 切片制作及免疫组织化学法

选取每例组织经病理学确诊的特征性部位，固定、洗涤、脱水及透明后，浸蜡和包埋组织，用于长期保存。采用5μm厚度切片机对石蜡组织进行切片。以ZIC5蛋白抗体为一抗工作液，稀释比例为1∶100，进行免疫组化实验：①60℃烤箱脱蜡及水化；②高温修复切片抗原；③试剂液A（内源性过氧化物酶阻断缓冲）和B（正常山羊血清）封闭后，孵育一抗，4℃过夜；④PBS洗净后孵育二抗（试剂液C，山羊抗兔／小鼠IgG抗体）及试剂液D（辣根过氧化酶标记链菌素）；⑤ DAB显色；⑥ 苏木素复染；⑦脱水透明及封片烘干；⑧镜下观察，拍照记录。应用免疫组化评分法（immunoreactive score，IRS）评估染色结果。按染色强度记分：未染、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别对应0、1、2、3分；按阳性细胞占比记分：1%～10%计1分，11%～20%计2分，21%～30%计3分，依此类推，91%～100%计10分；IRS＝染色强度分数×阳性细胞占比分数，以10分为截断值，IRS＞10为阳性。另外，以PBS替代一抗作为阴性对照。

1.4 统计学方法

所有数据分析均采用SPSS 20.0软件和Graphpad 6.0软件，计数资料采用χ2检验，计量资料采用成组配对t检验。采用Kaplan-Meier法分析5年总体生存期及无病生存期，并利用Log-Rank检验及Cox回归模型进行预后分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZIC5蛋白在结肠癌组织中的表达

ZIC5蛋白在结肠癌组织中主要分布在癌细胞核，阳性表达率为 71.05%（54／76），平均相对表达量为16.44±8.02；在癌旁组织中ZIC5蛋白亦分布在细胞核（图 1），阳性表达率为 23.68%（18／76），平均相对表达量为6.63±5.14。ZIC5蛋白在结肠癌组织平均表达量显著高于癌旁组织（t＝8.076，P＜0.01）。

图1 ZIC5蛋白在结肠癌组织及癌旁正常组织中的表达（免疫组化法×200）

2.2 ZIC5蛋白表达与结肠癌患者临床病理参数的关系

在76例结肠癌患者中，ZIC5蛋白表达阳性与患者高龄（P＝0.005）、癌组织低分化（P＜0.01）、淋巴结转移（P＝0.009）以及 Dukes C期（P＝0.015）密切相关，而与患者性别、结肠癌体积无明显相关（均 P＞0.05）。见表1。

2.3 ZIC5表达对结肠癌患者预后的影响

76例结肠癌患者Kaplan-Meier法分析结果见图2。22例ZIC5表达阴性患者5年总体生存期平均为（44.32±4.61）月，54例 ZIC5表达阳性患者为（25.11±2.79）月。ZIC5阴性患者5年总体生存期明显长于阳性病例（P＜0.01）；ZIC5阴性患者平均无病生存期为（41.86±4.93）月，ZIC5阳性患者为（21.28±2.68）月，ZIC5阴性患者无病生存期亦明显高于阳性病例（P＝0.001）。见图2。

表1 ZIC5蛋白在结肠癌中的表达与临床病理参数的关系

图2 ZIC5蛋白表达对结肠癌患者5年生存期影响的Kap lan-M eier分析

Cox回归分析显示，ZIC5蛋白表达水平（总体生存期：HR＝2.34，95%CI 1.22～4.46，P＝0.010；无病生存期：HR＝1.91，95%CI 1.31～2.79，P＜0.01）、淋巴结转移情况（总体生存期：HR＝2.73，95%CI 1.43～5.22，P＝0.002；无病生存期：HR＝2.34，95%CI 1.54～3.54，P＜0.01）及 Dukes分期（总生存期：HR＝3.15，95%CI 1.36～7.32，P＝0.008；无病生存期：HR＝3.48，95%CI 2.29～5.29，P＜0.01）是结肠癌患者重要的预后影响因素。

3 讨论

目前，临床上应用癌胚抗原、CA125、p16等指标对结肠癌患者手术根治后进行随访和评估，已获得很大收益［4-6］。然而，仍然有许多结肠癌复发病例术后血清学未能检测出这类基因异常表达，从而未能重视术后及时复查，导致术后死亡率仍然较高。因此，需要挖掘新型的潜在癌相关基因，以评估术后预后［7-9］。本研究应用免疫组化法检测ZIC5蛋白在结肠癌组织中的表达，结果显示ZIC5蛋白表达与患者年龄、结肠癌组织学分级、淋巴结转移情况及Dukes分期呈正相关，高表达者预后不佳。

ZIC5基因表达的ZIC5蛋白具有能与特定DNA结合序列（5′-TGGGTGGTC-3′）特异性结合的结构域，而ZIC5蛋白的这个结构域的作用相当于GLI蛋白，主要在神经系统发育中发挥作用［2］。有研究发现，ZIC5在非小细胞肺癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，且沉默肺癌H1299和H1703细胞株ZIC5后，癌细胞的增殖及侵袭力显著降低，癌细胞生长停滞在G2期［10］。本研究同样显示，ZIC5蛋白在结肠癌组织中的表达明显高于对应癌旁组织，且主要表达于细胞核。不仅如此，ZIC5蛋白的阳性表达与患者高龄、结肠癌低分化水平、淋巴结转移及Dukes C期相关，并且其阳性预示着肠癌患者术后5年总体生存期和无病生存期明显下降，提示对于这类患者，更需要加强术后肠癌复发的监测，以达到早发现、早治疗的目的。目前，对ZIC5基因作用机制的相关研究已显示，沉默ZIC5基因后的瘤体内CCNB1基因表达明显上调，而Ki67基因表达显著下降［10］；ZIC5基因有可能通过血小板源性生长因子D介导的FAK和STAT3基因的活化促进黑色素瘤的侵袭与浸润，这使之有可能成为化疗药物的靶点［11］。然而，国内有研究显示胃癌组织中ZIC5基因的表达水平与癌旁正常组织无明显差异，因此对预后评估意义不大［12］。在胃癌中的这一发现与本研究的主要结果并不一致，因此，还需开展进一步的预后调查，ZIC5的作用分子机制也需要深入研究。

综上，ZIC5蛋白的阳性表达与患者高龄、结肠癌低分化水平、结肠癌淋巴结转移及Dukes C期密切相关，并且其阳性预示着结肠癌患者术后预后不佳。