PIK3R1基因及其编码蛋白在宫颈鳞癌中的表达及临床意义

杨佩芳，丁小星，于骏，陈霞

（江苏大学附属医院妇科，江苏镇江212001）

我国女性宫颈癌发病率和死亡率呈逐年上升的趋势［1］。宫颈鳞状细胞癌是宫颈癌最多的病理类型，约占 80%以上［2］。

磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）是磷脂激酶中的一个家族，是细胞应答并且传递细胞间信号的重要协调者［3-4］。根据结构不同，PI3K分为三类，包括Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类。PIK3R1是Ⅰ类PI3K的调节亚基之一，编码p85α蛋白。研究显示，乳腺癌中存在p85α表达缺失，该缺失致PI3K活性增强，最终导致肿瘤的发生［5］。p85α能够直接与人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（PTEN）相互作用，增强PTEN脂质磷酸酶活性从而负向调节肿瘤的发展，而PTEN基因的缺失、突变、甲基化与肿瘤的发生密切相关，其通过抑制磷酸化酶的活性而抑制肿瘤的发生发展，广泛认为是一种抑癌基因。但是，p85α蛋白在宫颈癌中的表达情况尚不清楚。因此，本研究通过检测p85α蛋白及其编码基因PIK3R1在宫颈鳞癌组织中的表达，探讨其与宫颈鳞癌发病的关系，并检测PTEN在宫颈鳞癌中的表达水平，分析PTEN与PIK3R1在宫颈鳞癌中的表达是否存在相互关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

38例宫颈鳞癌和39例良性宫颈石蜡包埋组织取自江苏大学附属医院病理科。宫颈肿瘤病理类型由江苏大学附属医院病理科医师依据显微镜下宫颈组织形态确诊。按照FIGO分期，其中Ⅰ期16例，Ⅱ期12例，Ⅲ+Ⅳ期（晚期）共10例。年龄34～82岁，平均年龄（55.47±12.22）岁。同时收集 2017年1月至12月于江苏大学附属医院妇科门诊行宫颈活检术的新鲜宫颈（术后石蜡病理确诊为宫颈鳞癌）组织标本19例，患者年龄38～75岁，平均（54.11±10.80）岁；另选择同期因子宫良性疾病行全子宫切除手术的良性宫颈组织19例，作为对照，患者年龄38～70岁，平均（47.21±7.16）岁。本研究经江苏大学附属医院生物医学伦理委员会批准，所有临床标本经患者同意后获取。

病例入选标准：石蜡病理切片确诊为宫颈鳞癌；有至少2名经验丰富的妇瘤医师评估得出准确FIGO分期；病例排除标准：已接受过恶性宫颈肿瘤的治疗（新辅助放疗、化疗）；有其他实体恶性肿瘤、血液系统疾病的存在。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 手术切除的组织立即放置于冰上，生理盐水冲洗去除血凝块及宫颈黏液和分泌物，并于20 min内送至本院中心实验室-80℃保存。

1.2.2 组织HE染色 蜡块切片，透明，置于梯度乙醇（浓度分别为95%、85%、75%）中各2 min，蒸馏水洗净，苏木精溶液染色10 min，流水冲洗1min；然后浸入1%盐酸乙醇10～20 s，水洗1min，温水蓝化1 min，水洗2 min，切片置于75%乙醇中浸1min，伊红染色1 min，置于梯度乙醇（浓度分别为85%和95%）中各1 min，100%乙醇脱水5 min，二甲苯透明，滴树胶，封片，显微镜下进行观察。

1.2.3 免疫组织化学检测p85α蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达

1.2.3.1 实验步骤 蜡块切片脱蜡，依次置于浓度分别为100%、95%、85%、75%乙醇中浸泡5 min；切片置于沸腾的枸橼酸缓冲液中5 min行抗原修复，待其自然冷却；Tween-20细胞通透，增加细胞通透性，减少背景着色；3%H2O2消除内源性过氧化物酶；山羊血清滴于组织切片，湿盒常温孵育25 min，封闭非特异性蛋白；滴加一抗（兔抗人p85α多克隆抗体1∶40），PBS代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜；PBS冲洗、滴加二抗（羊抗兔IgG，即用型），室温孵育25 min；PBS冲洗，DAB显色，当组织颜色变为巧克力样色时加PBS溶液终止反应；苏木精复染2 min，流水冲洗；置于1%盐酸乙醇中5 s，流水冲洗；温水返蓝5min，流水冲洗；脱水、二甲苯透明、封片、显微镜下进行观察。其中，兔抗人多克隆抗体p85α、羊抗兔IgG聚合物均购于上海生工生物工程有限公司；DAB显色液、Tween-20为福州迈新公司。

1.2.3.2 结果评定 组织阳性染色标准为细胞质中出现颗粒状或成片的巧克力样着色。400×高倍镜下随机选取10个视野，观察阳性细胞所占的比例，取平均值。根据着色细胞百分比及细胞着色深浅分别计分判定结果：阳性细胞百分比＜10%为0分，10%～29%为1分，30%～49%为2分，≥50%为3分；细胞着色深浅：0分为不着色，1分为浅棕色，2分为棕黄色，3分为铁锈色。两项得分相乘即为总得分：＜3分为阴性，≥3分阳性。

1.2.4 RNA提取、逆转录、实时荧光定量 PCR（qRT-PCR） Trizol法提取组织总RNA，紫外分光光度计检测总 RNA的 D（260 nm）／D（280 nm）值，并保证值为1.8～2.1。然后进行反转录，10μL体系中加入5×缓冲液 2μL，反转录酶0.5μL、寡核苷酸（50μmol／L）0.5μL，6核苷酸的随机引物（100μmol／L）0.5μL，总 RNA为 500 ng／RNA浓度，不足部分加入无RNA酶水补充，反转录条件：37℃15 min，85℃5 s，4℃恒温。10μL的qRT-PCR总反应体系中包括荧光染料混合液5μL，上、下游引物各 0.2μL，cDNA模板 0.4μL，其余部分用无RNA酶水补充。目的基因PIK3R1、PTEN及内参GAPDH的引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列及扩增长度见表1。反转录和实时荧光定量PCR试剂盒购于TaKaRa公司，操作步骤按照试剂盒说明书进行，检测仪器为Agilent Mx3000P（美国Stratagene公司）。

1.2.5 基因相对表达水平 实验以GAPDH作为内参照，采用相对定量方法进行分析，采用2-△△Ct的方法计算PIK3R1和PTEN在宫颈鳞癌组织中的相对表达水平。

表1 引物序列及扩增长度

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 6.0作图进行分析，采用SPSS 22.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，p85α在良性宫颈组织和宫颈鳞癌组织中的阳性率采用卡方检验、PIK3R1和PTEN表达相关性采用Pearson相关分析、宫颈鳞癌组织中p85α的表达与各临床参数的相关性采用Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织HE染色结果

良性宫颈由鳞状上皮细胞、鳞柱状上皮交接和柱状上皮细胞组成，细胞形态结构完好，细胞核无增大且细胞无变形。宫颈鳞癌组织中，肿瘤未累及的宫颈鳞状上皮细胞异型严重，甚至消失，见较多形态异常、染色加深的蓝紫色细胞核，肿瘤累及的宫颈正常形态结构消失，由不同程度增生的异型肿瘤细胞取代，肿瘤细胞核增大、变形、分裂，细胞核染色变深，肿瘤细胞呈团块状聚集。见图1。

图1 良性宫颈组织和宫颈鳞癌组织形态（HE染色×40）

2.2 p85α在宫颈鳞癌组织和良性宫颈组织中的表达

免疫组化结果显示，p85α蛋白在良性宫颈组织中高表达，主要表达于细胞质中。p85α蛋白在宫颈复层鳞状上皮的基底细胞中表达更多，在宫颈鳞癌细胞中表达较少，甚至不表达。见图2。与良性宫颈组织相比，p85α在宫颈鳞癌组织中的表达显著降低（t＝6.034，P＜0.01）。见图3。

图2 宫颈鳞癌组织和良性宫颈组织中p85α蛋白的表达

图3 p85α蛋白在良性宫颈组织和宫颈鳞癌组织中的表达评分

p85α在良性宫颈组织和宫颈鳞癌组织中分别有35例（89.7%，35／38）和 17例（44.7%，17／38）呈阳性表达，宫颈鳞癌组中p85α阳性表达率显著低于良性宫颈组（χ2＝17.781，P＜0.01）。

2.3 p85α在宫颈鳞癌中的表达与各临床参数的关系

p85α的表达与临床病理分期及转移情况具有相关性（P＝0.001，0.016），病理分期越高，p85α表达越低；有远处转移的肿瘤组织中p85α表达较无远处转移的肿瘤组织表达低；但尚不能表明其表达与年龄和分化程度有相关性（P＞0.05）。见表2。

表2 p85α在宫颈鳞癌组织中的表达与各临床参数的关系

2.4 PIK3R1和PTEN基因在宫颈鳞癌组织中的表达

qRT-PCR结果显示，与良性宫颈组织相比，PIK3R1和PTEN在宫颈鳞癌组织中表达均明显下调（PIK3R1 mRNA：t＝8.266；PTEN mRNA：t＝5.172，P均 ＜0.01）。见图4。

图4 PIK3R1和PTEN在宫颈鳞癌组织中的表达

2.5 宫颈鳞癌组织中PIK3R1和PTEN表达相关性分析

相关性分析显示，PIK3R1和PTEN两者表达呈中等相关（r＝0.567，P＝0.011）。

3 讨论

PI3K是一个复杂的大家族，其通过与细胞膜上的受体作用，介导外部信号传递入细胞内部，进而影响细胞的增殖、存活和葡萄糖代谢等过程［6］。PI3K异常表达与肿瘤发生密切相关［7-8］，因此，近来PI3K广泛用来作为潜在的肿瘤治疗靶点。PIK3R1是Ⅰ类PI3K的调节亚基，共编码3种蛋白，分别是p85α、p55α、p50α，其中，p85α蛋白结构具有完整性。因此，p85α能够直接与PTEN基因结合并增强PTEN脂质磷酸酶活性［9］，从而抑制肿瘤的发展。

以往有研究显示，p85α在实体恶性肿瘤中表达下调，本实验结果显示，p85α在宫颈鳞癌组织中显著下调，且随分期升高表达越低；此外，p85α在转移宫颈鳞癌组织中较无转移宫颈鳞癌组织表达更低，由此表明，p85α低表达在宫颈侵袭的过程中可能发挥负面作用。研究报道，PIK3R1在多种实体恶性肿瘤中表达下调，通过抑制肿瘤细胞的生长发挥抑癌基因的作用［10］，也有研究发现PIK3R1减少的程度与肿瘤的分期及预后显著相关［11］，这些研究表明PIK3R1在一些肿瘤中发挥抑癌基因作用。本实验结果显示，与良性宫颈组织相比，PIK3R1在宫颈鳞癌中的表达水平显著降低，可能在宫颈鳞癌的发生过程中发挥负面作用。

研究发现，PTEN能够抑制PI3K的活性，其作为磷酸酯酶将磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3）转化为磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2），致PI3K的产物减少，通过负调节PI3K的信号传导过程，抑制PI3K通路的异常活化。本实验通过相关性分析发现，PIK3R1与PTEN在宫颈鳞癌中的表达呈中等相关，但两者是否通过相关途径发挥作用，还需后续深入研究。

宫颈鳞癌组织中p85α及其编码基因PIK3R1表达均显著降低，且p85α表达与肿瘤的进展与侵袭相关，因此，我们认为p85α的缺失可能参与宫颈鳞癌的发生，并且PIK3R1可能与PTEN相互作用，共同发挥抑癌基因的角色，具体作用机制还有待进一步研究。