Lnc-OC1和miR-34在结直肠癌组织中的表达及相关性

石键，周武碧

（南京医科大学附属淮安第一医院1.检验科，2.病理科，江苏淮安223300）

长链非编码 RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类新发现的具有有限或无蛋白质编码能力的 RNA，长度为200 nt～100 kb［1-4］。lncRNAs在染色体失活、细胞分化、基因组印迹和细胞增殖等多种生物学过程中起重要的调控作用［5-6］。长链非编码RNA-卵巢癌相关1（long non-coding RNA-ovarian cancer associated 1，Lnc-OC1）在卵巢癌组织中呈高表达，其促进卵巢癌细胞的增殖和转移，且与卵巢癌患者的不良预后相关［7］。miRNAs是一类约22 nt的非编码RNA，通过结合mRNA调控其翻译和降解［8-9］，其中，miR-34在结直肠癌的进展中起重要作用。研究发现，miR-34在结直肠癌中呈低表达［10］，其可以抑制结直肠癌迁移和增殖，并且能够提高结肠癌细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶的敏感性［11-13］。Lnc-OC1在结直肠癌中的作用尚不完全清楚，因此，本研究采用实时荧光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）检测Lnc-OC1与miR-34在结直肠组织及癌旁组织中的表达及相关性，探讨Lnc-OC1对结直肠癌迁移的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

包含80例结直肠癌组织和15例癌旁组织的cDNA芯片为上海芯超生物科技有限公司产品，产品编号为cDNA-HColA095Su02，包含完整的临床病理资料和随访资料；患者手术时间为2006年2月至2010年2月，随访时间至2015年9月，随访5～9年，死亡44例，患者术前均未经过放射治疗和化学治疗。

1.2 仪器与试剂

RT-PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；CFX96 PCR仪（美国伯乐公司）。

1.3 qRT-PCR检测Lnc-OC1和miR-34表达

采用试剂盒检测Lnc-OC1和miR-34的表达，其中，GAPDH为Lnc-OC1内参，18 S rRNA为miR-34内参。RT-PCR引物序列如下，Lnc-OC1上游引物为5′-GGCCTGTGTGTTGAATGCTG-3′，下游引物为 5′-CTGTGGTCACAAAGGCCTGA-3′；miR-34上游引物为 5′-ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA-3′，下 游 引物为 5′-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3′；内 参GAPDH上游引物为5′-TCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′，下游引物为 5′-TTGGAGGGATCTCGCTCCT-3′；18 S rRNA上游引物为 5′-CGGCTACCACATCCTATGAA-3′，下游引物为 5′-TGGAGCTGGAATTACCGCGG-3′。PCR反应体系共 20μL，其中，荧光混合物10μL，10μmol／L上游引物和下游引物各1 μL，50×ROX染料Ⅱ 0.5μL、cDNA模板 1μL，双蒸水6.5μL。上述反应均在冰上进行。反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，60℃退火，延伸30 s，共35个循环。通过公式2-△△Ct计算相对表达量。每组实验重复3次。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 结直肠癌组织中Lnc-OC1和miR-34的表达及其与临床病理参数间的关系

结直肠癌组织中Lnc-OC1的表达水平（0.70±0.12）明显高于癌旁组织（0.36±0.05），差异具有统计学意义（t＝19.315，P＜0.001）；结直肠癌组织中miR-34的表达水平（0.61±0.18）明显低于癌旁组织（0.91±0.05），差异具有统计学意义（t＝12.507，P＜0.001）。Lnc-OC1与患者的年龄、性别、肿瘤直径、组织分化无相关性（P＞0.05），而与淋巴结转移、TNM分期相关（P＜0.05）。见表1。

2.2 结直肠癌组织中Lnc-OC1与miR-34间的相关性

相关性结果显示，结直肠癌组织中Lnc-OC1的相对表达水平与 miR-34表达呈负相关（r＝-0.967，P＜0.001）。见图1。

表1 肿瘤组织中Lnc-OC1的表达与临床病理参数间的关系

图1 结直肠癌组织中Lnc-OC1与miR-34表达间的相关性

2.3 结直肠癌组织中Lnc-OC1表达与患者预后的关系

生存分析结果表明，Lnc-OC1高表达患者的总体生存率（8／40）低于 Lnc-OC1低表达患者（28／40，χ2＝19.72，P＜0.001）。多因素 Cox回归分析结果表明，结直肠癌组织中Lnc-OC1的表达是结直肠癌患者预后不良的独立危险因素（P＜0.01）。见表2。

图2 直肠癌患者Lnc-OC1不同表达水平的Kap lan-M eier生存曲线

表2 结直肠癌患者预后因素的单因素和多因素分析

3 讨论

研究报道，Lnc-OC1在卵巢癌中高表达且可促进卵巢癌细胞增殖、侵袭和转移，Lnc-OC1高表达的卵巢癌患者总体生存率较Lnc-OC1低表达者明显降低［7］。本研究结果显示，Lnc-OC1在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织，表明Lnc-OC1可能参与结直肠癌的发生，其高表达可能导致结直肠癌组织上皮过度增殖或突变，从而形成肿瘤。Lnc-OC1与结直肠癌淋巴结转移相关，而且TNM分期越高，结直肠癌组织中Lnc-OC1表达越高，提示Lnc-OC1与结直肠癌的发展密切相关，在结直肠癌中可能也促进癌细胞迁移。此外，Lnc-OC1高表达的结直肠癌患者总体生存率较Lnc-OC1低表达患者明显降低。结直肠癌组织中Lnc-OC1高表达是患者总体生存率的独立危险因素，提示Lnc-OC1在结直肠癌中同样可以作为预后标志物，其高表达提示结直肠癌患者预后不良。

miR-34在多种肿瘤如胃癌、肺癌、胰腺癌和急性淋巴细胞白血病中低表达［14-17］，其在多种类型肿瘤中具有强抑癌作用［18］。本研究结果显示，miR-34在结直肠癌组织中呈低表达，且Lnc-OC1表达与miR-34表达呈负相关，由此推测Lnc-OC1可能通过抑制miR-34表达从而促进结直肠癌的发生发展，但是结直肠癌中两者是否存在调控关系需要进一步实验验证。

综上，Lnc-OC1在结直肠癌组织中呈高表达，可促进结直肠癌细胞迁移，其可作为结直肠癌患者潜在的预后标志物。