高效液相色谱法测定红臀软膏中维生素A的含量

王文郁 杨钊

红臀软膏为江苏省淮安市第一人民医院生产的软膏剂,用于治疗和预防婴幼儿红臀［1-5］。主要成分为鱼肝油, 维生素A为鱼肝油的有效成分, 测定维生素A的含量, 可为控制红臀软膏的质量以及临床用药提供科学参考依据［6-10］。

1 仪器与试药

1.1 仪器 METTLER PL602-S电子天平；METTLER AB204-S电子天平；KH-300B型超声波清洗器仪；Agilent 1260高效液相色谱仪；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 µm)。

1.2 试剂 甲醇为色谱纯；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。对照品：维生素A醋酸酯(中检院, Vitamln A Acetate ,批号：100368-201301, 含量：按C22H32O2计, 本品每1克中含维生素A醋酸酯343 mg)。样品：红臀软膏(淮安市第一人民医院 , 批号 160801、160803、160728, 规格：20 g/支 )。鱼肝油, 阴性样品(淮安市第一人民医院, 不含鱼肝油)。

2 方法与结果

2.1 色谱方法

2.1.1 含量测定 按照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。色谱条件与系统适用性试验采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水(90∶10)为流动相, 柱温为35℃, 流速为1.0 ml/min, 检测波长为328 nm。维生素A醋酸酯峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。

2.1.2 测定法 精密称取本品1 g, 置500 ml分液漏斗中,用三氯甲烷-水(5∶2)振摇提取4次, 1 ml/次, 合并三氯甲烷液, 三氯甲烷液于60℃水浴上蒸干, 残渣加正己烷溶解并转移置20 ml量瓶中, 用正己烷稀释至刻度, 摇匀, 作为供试品溶液, 精密量取10 µl注入液相色谱仪, 记录色谱图；另取维生素A醋酸酯对照品适量, 精密称定, 加正己烷溶解并定量稀释制成每1毫升中含6 µg溶液, 作为对照品溶液, 同法测定。按外标法以峰面积计算, 即得。每1克中含维生素A应为 87.72～113.52 µg。

2.2 线性与范围 精密称取维生素A醋酸酯对照品0.9251 g(含维生素A醋酸酯317.3093 mg)置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 摇匀, 精密吸取2 ml置100 ml量瓶中, 即得对照品贮备液①, 维生素A醋酸酯浓度为126.9238 µg/ml；从对照品贮备液①精密吸取25 ml, 置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 摇匀, 即得对照品贮备液②, 维生素A醋酸酯浓度为63.4619 µg/ml；从对照品贮备液②精密吸取4 ml,置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 摇匀, 即得对照品贮备液③, 维生素A醋酸酯浓度为5.0769 µg/ml；分别精密量取对照品贮备液①0.5 、1、2、5、10 ml置50 ml量瓶中, 用正己烷稀释至刻度, 摇匀。各精密量取10 µl注入液相色谱仪, 记录色谱图。各溶液浓度值及其峰面积见表1。以峰面积值(Y)对维生素A醋酸酯浓度(X)进行线性回归, 求得回归方程：Y=90.079X-0.4124, R=0.9999。见图1。维生素A醋酸酯在1.269～25.380 µg/ml范围内, 峰面积值与进样浓度有良好的线性关系。

表1 各线性溶液浓度值及其峰面积

2.3 准确度 加样回收试验：采用向鱼肝油与阴性样品中加入已知量的维生素A醋酸酯对照品进行测定。根据药品质量标准分析方法验证指导原则(《中国药典》2015年版四部通则9101), 红臀软膏中维生素A醋酸酯含量约为0.01%, 回收率限度应为85%～110%。

精密称取鱼肝油5.0434 g、阴性样品2.4600 g, 置500 ml分液漏斗中, 加三氯甲烷-水(5∶2)振摇提取4次, 取三氯甲烷层, 合并每次三氯甲烷层, 弃去水液, 置蒸发皿中, 于60℃水浴上蒸干, 蒸干后残渣加正己烷溶解并转移至50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 摇匀, 作为供试品溶液贮备液①。

各精密量取供试品贮备液①5 ml, 置9个50 ml量瓶中。3个量瓶一组, 每组分别加入对照品贮备液②4、5、6 ml, 用正己烷稀释至刻度, 摇匀。按上述色谱方法测定。见表2。

表2 准确度试验结果

精密量取对照品贮备液②5 ml置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 摇匀, 精密量取10 µl注入液相色谱仪,连续进5针, 记录色谱图。精密量取供试品贮备液5 ml, 置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 摇匀, 即得本底值浓度的样品, 精密量取10 µl注入液相色谱仪, 记录色谱图。按外标法以峰面积计算。

2.4 专属性 分别精密量取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液(采用阴性样品配制, 方法同供试品溶液)及正己烷溶剂各10 µl, 注入液相色谱仪, 记录色谱图。精密量取对照品贮备液②5 ml置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 摇匀, 作为对照品溶液。同精密称取鱼肝油①0.2118 g、②0.2123 g分别置20 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度摇匀。鱼肝油①以外标法按峰面积计算得：鱼肝油①的维生素A醋酸酯的含量为0.5321 mg/g；鱼肝油②以外标法按峰面积计算得：鱼肝油②的维生素A醋酸酯的含量为0.5317 mg/g；鱼肝油的维生素A醋酸酯的含量平均值为0.5319 mg/g。

精密称取①鱼肝油0.1926 g, 不含鱼肝油的阴性样品0.8416 g, ②鱼肝油0.1931 g, 不含鱼肝油的阴性样品0.8089 g,分别置500 ml分液漏斗中, 用三氯甲烷-水(5∶2)振动摇提取四次, 合并每次的三氯甲烷液, 置同一蒸发皿中于60℃水浴上蒸干, 将蒸干后的残渣用正己烷溶解, 并转移置20 ml量瓶中, 加正己烷定容至刻度, 摇匀。

①鱼肝油0.1926 g与不含鱼肝油的阴性样品0.8416 g混合；以外标法按峰面积计算得：维生素A醋酸酯的含量为0.5319 mg/g；②鱼肝油0.1931 g与不含鱼肝油的阴性样品0.8089 g混合, 以外标法按峰面积计算得：维生素A醋酸酯的含量为0.5321 mg/g维生素A醋酸酯的含量平均值为0.5320 mg/g。

精密称取样品①1.4337 g、②1.4194 g(批号：160801),①0.9785 g、②0.9567 g(批号：160728)、①0.9976 g、②0.9779 g(批号：160803)分别置500 ml分液漏斗中, 用三氯甲烷-水(5∶2)振摇提取四次, 合并每次的三氯甲烷液, 置同一蒸发皿中于60℃水浴上蒸干, 将蒸干后的残渣用正己烷溶解, 并转移置20 ml量瓶中, 加正己烷定容至刻度, 摇匀。

①以外标法按峰面积计算得：维生素A醋酸酯的含量为0.0812 mg/g；160801②以外标法按峰面积计算得：维生素A醋酸酯的含量为0.0815 mg/g维生素A醋酸酯的含量为0.0814 mg/g；160728①以外标法按峰面积计算得：维生素A醋酸酯的含量为0.0796 mg/g；160728②以外标法按峰面积计算得：维生素A醋酸酯的含量为0.0801 mg/g；维生素A醋酸酯的含量为0.0798 mg/g；160803①以外标法按峰面积计算得：维生素A醋酸酯的含量为0.0821 mg/g；160803②以外标法按峰面积计算得：维生素A醋酸酯的含量为0.0818 mg/g；维生素A醋酸酯的含量为0.0820 mg/g。供试品溶液在对照品溶液主峰保留时间相同处有相应色谱峰(18.6 min), 理论板数按维生素A醋酸酯峰计为11968；阴性样品溶液及溶剂在与对照品相应的保留时间无色谱峰出现,说明阴性样品及溶剂无干扰。

2.5 耐用性 对照品溶液稳定性：精密量取对照品贮备溶液①2 ml, 置50 ml量瓶中, 加正己烷溶解并定容至刻度, 摇匀, 制成1 ml含维生素 A醋酸酯 5.0769 µg溶液, 在 0、2、4、8、24 h进样, 测定对照品溶液稳定性。见表3。结果表明,对照品溶液在24 h内稳定。

表3 供试品溶液稳定性试验结果

3 小结

按照药品质量标准分析方法验证指导原则(2015年版《中国药典》四部通则9101)要求, 进行方法验证试验。结果表明, 本法准确可靠, 可用于红臀软膏的含量测定。